肝臟是人體重要的代謝和內(nèi)分泌器官，參與消化、糖脂代謝和免疫等多種生化過程。蘑菇作為藥物和功能性食品應用已有數(shù)千年的歷史。雙孢菇（

Agaricus bisporus

云南中醫(yī)藥大學王杰、何紅平*和河南大學國家食用菌加工技術研發(fā)專業(yè)中心的王金梅等采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術對ABEE的化學成分進行鑒定，采用網(wǎng)絡藥理學方法，對相關化合物保肝活性的作用靶點及通路進行預測，同時使用CCl4致小鼠肝損傷動物模型對相關靶點進行驗證，以期為雙孢菇開發(fā)肝損傷保護功能食品提供理論依據(jù)。

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ABEE中有效成分鑒定結果

本研究采用UPLC-MS/MS技術對ABEE的化學成分進行快速鑒定，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與BGI Library數(shù)據(jù)庫進行匹配，根據(jù)各色譜峰的得分信息對所鑒定化合物進行初步篩選，并根據(jù)各成分的一級質(zhì)譜信息和二級質(zhì)譜信息進一步確定。由圖1可知，各色譜峰保留時間與響應強度重疊度較高，儀器數(shù)據(jù)采集穩(wěn)定性高，數(shù)據(jù)可靠。

進一步以數(shù)據(jù)庫分析鑒定的Level、Match值為篩選條件進行篩選，當Level值≥2及Match值≥85時化合物可信度較高，給予保留，31 個化學成分在負離子模式下被鑒定（表2），44 個化學成分在正離子模式下被鑒定得到（表3），2 種模式下重復的化合物均統(tǒng)計在正離子模式下，共得到75 個化合物，脂肪酸、氨基酸和羧酸等類型化合物占主要部分，脂肪酸類成分包括亞麻酸、棕櫚酸等，氨基酸類成分包括麥角硫因、4-乙酰氨基丁酸等，表明ABEE中化學成分復雜，化合物種類多樣。

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ABEE肝臟保護作用網(wǎng)絡藥理學研究

2.1 ABEE活性成分篩選及作用靶點獲取

將上述75 個化學成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和SwissADME數(shù)據(jù)庫進一步篩選，符合篩選條件的化合物共有44 個，其次，通過Swiss target prediction、TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢有效成分作用靶點并進行篩選，將重復靶點去除，已證實的基因注釋文件通過Uniprot數(shù)據(jù)庫下載，將ABEE有效化學成分所對應的靶點進行標準名稱轉換，最終得到44 個化學成分符合上述條件，共有372 個靶點與之對應（表4），其中白楊素對應靶點最多，屬于黃酮類化合物，其次是氨基酸類、脂肪酸類化合物。

2.2 有效成分作用靶點與肝損傷相關靶點交集分析

在 GeneCards 、 OMIM 、 PharmGKB 、 TTD 和DrugBank 5 個數(shù)據(jù)庫中檢索肝損傷相關靶點，結果分別得到 9 101 、 61 、 176 、 94 、 5 個相關靶點，進一步合并、去除重復，得到 9 212 個肝損傷相關的基因靶點（圖 2A ）。使用 R 語言程序?qū)⒂行С煞謱?372 個靶點去除重復，共得到有效成分靶點 201 個，與 9 212 個肝損傷疾病相關靶點做交集，映射后獲得 ABEE 作用靶點與肝損傷疾病靶點的共有靶點 173 個，并繪制 Venn 圖（圖 2B ）。這 173 個交集靶點可能為 ABEE 治療肝損傷的潛在靶標。利用 44 個有效成分和 173 個肝損傷相關靶點構建“有效成分 - 靶點”調(diào)控網(wǎng)絡圖（圖 2C ）。

2.3 PPI網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選

通過STRING構建173個交集靶標的PPI網(wǎng)絡（圖3A），使用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡進行拓撲屬性分析，選取中介中心性、緊密中心性、度中心性、特征向量中心性、局部邊連通性、網(wǎng)絡中心性6 個拓撲屬性參數(shù)，并以各自中位值作為篩選關鍵靶點的條件。第一次分析得到35 個核心靶點（圖3B），二次篩選得到11 個核心的基因靶點（圖3C），調(diào)控核心靶點的對應化合物如表5所示。這些化合物可能是ABEE發(fā)揮肝臟保護作用的關鍵成分。

2.4 GO和KEGG富集分析結果

對上述 173 個交集基因進行信號通路富集分析，將 GO 富集分析生物工程、細胞組分、分子功能結果中前 10 個結果及其富集的靶點個數(shù)采用條形圖展示（圖 4A ），分析結果顯示， ABEE 的作用方式與脂肪酸衍生物代謝過程、活性氧物質(zhì)代謝過程、類固醇代謝過程有關。 KEGG 富集分析鑒定 139 條途徑，將前 10 條結果采用氣泡圖展示（圖 4D ），分析顯示化學致癌 - 受體激活通路所富集靶點最多， P 值較小， ABEE 可能是通過癌癥相關通路以及氨基酸代謝相關通路發(fā)揮作用。進一步將所富集的 139 條通路進行二級分類（圖 4B ），發(fā)現(xiàn) 139 條通路主要富集在氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、癌癥等相關通路。進一步說明 ABEE 可能通過脂質(zhì)代謝、癌癥等通路發(fā)揮作用。在前 10 條富集通路中挑選包含核心靶點的相關通路并采用 CNET 圖對相關作用靶點進行展示（圖 4C ）。

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ABEE對小鼠肝組織病理結構的影響

為研究ABEE對CCl 4誘導的小鼠肝損傷的保護作用，對小鼠肝臟組織切片并H&E染色，顯微鏡下觀測肝組織細胞的受損情況，探究ABEE的肝臟保護作用，如圖 5 所示，空白組核質(zhì)分布均勻，細胞質(zhì)豐富，細胞核清晰，肝板、肝血竇 排列規(guī)則。模型組（圖 5B ）小鼠肝臟組織細胞出現(xiàn)嚴重病變，肝板排列紊亂，細胞核萎縮，肝細胞大面積壞死并伴有空泡化，部分肝細胞出現(xiàn)水變性。而與模型組相比， ABEE 高劑量組（圖 5D ）治療后肝臟組織病理形態(tài)有明顯改善，肝細胞損傷明顯減輕。結果表明， ABEE 對于 CCl 4 誘導的小鼠肝損傷具有顯著的保護作用。

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ABEE對小鼠肝功能水平的影響

AST、ALT、AKP是臨床評價肝臟受損的重要標志性指標，如圖 6 所示，模型組小鼠血清中 AST 、 ALT 和 AKP水平都顯著高于空白組（ P ＜ 0.001 ），表明 CCl 4 誘發(fā)了小鼠的肝臟損傷。在給藥治療后，陽性藥組和高劑量組的水平得到顯著改善（ P ＜ 0.001 ）。這些結果表明 CCl 4 誘導的肝損傷小鼠的 AST 、 ALT 和 AKP 水平能夠被 ABEE 改善，并且 ABEE 給藥組對小鼠 AST 、 ALT 指標降低呈現(xiàn)較好的劑量依賴性。

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ABEE對小鼠抗氧化能力的影響

如圖 7 所示，與空白組相比，模型組小鼠血清中SOD 活力（圖 7A ）、 GSH-Px 活力（圖 7B ）極顯著降低（ P ＜ 0.001 ）， MDA 含量（圖 7C ）顯著升高。高劑量ABEE 和陽性藥組能顯著逆轉這種降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性。同時與模型組相比，低劑量和中劑量組的 MDA 含量顯著降低。結果表明 ABEE 可能是通過增強小鼠抗氧化能力來達到保護肝臟的作用。

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ABEE對核心基因mRNA表達水平的影響

在前期研究中，通過網(wǎng)絡藥理學預測了 ABEE 肝臟保護作用靶點，得到 11 個具有潛在作用的核心靶點，分別是 Bcl-2 、 RELA 、 MYC 、 MMP9 、 NF-κB1 、 HSP90AA1 、CASP3 、 PPARG 、 PTGS2 、 IL10 、 TNF ，以上 11 個靶點的 mRNA 的表達量通過熒光定量 PCR 技術檢測。檢測結果（圖 8 ）顯示高劑量組與模型組相比， Bcl-2 、RELA 、 MYC 、 MMP9 、 NF-κB1 mRNA 表達量出現(xiàn)顯著性變化，其余 6 個基因并未出現(xiàn)顯著性變化，故對 Bcl-2 、RELA 、 MYC 、 MMP9 、 NF-κB1 基因進行進一步分析。如圖 8 所示，與空白組相比，模型組小鼠肝臟組織中MYC 、 NF-κB1 、 MMP9 、 RELA 基因表達水平顯著升高（ P ＜ 0.001 、 P ＜ 0.01 、 P ＜ 0.05 、 P ＜ 0.05 ），而 Bcl-2 基因的表達水平顯著降低（ P ＜ 0.001 ）。給予 ABEE 處理后結果逆轉，高劑量組 MYC 、 MMP9 、 NF-κB1 和 RELA 基因表達水平顯著降低（ P ＜ 0.01 ）， Bcl-2 基因表達水平顯著升高（ P ＜ 0.001 ）。據(jù)此推測， ABEE 的肝臟保護作用可能是通過調(diào)節(jié)基因 Bcl-2 、 RELA 、 MYC 、 MMP9 、 NF-κB1的表達，進而調(diào)控相關通路實現(xiàn)。

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ABEE對Bcl-2、RELA、MYC、MMP9、NF-κB1蛋白表達水平的影響

進一步采用 Western blot 法檢測 Bcl-2 、 RELA 、MYC 、 MMP9 、 NF-κB1 蛋白的表達情況，結果如圖 9 所示。與空白組相比，小鼠在 CCl 4 造模之后 MYC 、MMP9 、 NF-κB1 以及磷酸化的 RELA （ p-RELA ）水平明顯升高， Bcl-2 的蛋白表達水平降低，經(jīng)過量化分析具有顯著性差異（ P ＜ 0.01 ）。給予 ABEE 組，與模型組相比， NF-κB1 、 MYC 、 p-RELA 以及 MMP9 水平顯著降低（ P ＜ 0.05 、 P ＜ 0.05 、 P ＜ 0.01 、 P ＜ 0.001 ），而Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高（ P ＜ 0.001 ）。由此進一步表明， ABEE 可以影響 Bcl-2 、 RELA 、 MYC 、 MMP9 、NF-κB1 蛋白的表達，推測 ABEE 的肝臟保護作用可能是通過影響上述基因的表達，進而影響相關通路而實現(xiàn)。具體作用機制還需進一步研究。

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本研究發(fā)現(xiàn)ABEE能顯著改善CCl4誘導的肝損傷小鼠的AST、ALT和AKP水平，改善肝臟病理組織形態(tài)，提高SOD、GSH-Px活力，降低MDA含量，對肝損傷具有較好的保護作用。其保肝作用方式與其他食用菌相似，通過提高小鼠機體清除自由基的能力、減少脂質(zhì)過氧化反應的發(fā)生，進而對肝細胞起到一定的保護作用。

MYC蛋白是參與調(diào)節(jié)細胞增殖，細胞凋亡和許多代謝途徑的轉錄因子，研究發(fā)現(xiàn)，對乙酰氨基酚（APAP）誘導的急性肝損傷實驗中，c-Myc的缺失減輕了APAP誘導的肝臟損傷，本實驗中，與空白組相比，模型組MYC的mRNA和蛋白表達顯著升高，與模型組相比，高劑量組表達量明顯降低，說明ABEE可能是通過降低MYC的表達從而實現(xiàn)肝臟保護的作用。

RELA（NF-κB?p65）是NF-κB家族成員之一，參與許多生物學過程，如細胞生長、腫瘤發(fā)生和凋亡。在硫代乙酰胺致肝損傷模型中，RELA基因表達量增加，給藥后發(fā)生逆轉，肝損傷減弱，這與本實驗結果一致。

NF-κB1（NF-κB?p50）是NF-κB家族成員，編碼p50蛋白，在細胞生存、增殖和凋亡多個生物過程中起重要作用，可以與其他NF-κB家族成員形成異二聚體，或與自身形成同二聚體。異二聚體（例如p50/p65）能夠結合到DNA上的特定κB位點，啟動下游目標基因的轉錄。多項研究表明，CCl4處理會導致小鼠肝臟中NF-κB1基因的表達增加。本實驗中與空白組相比，模型組NF-κB1基因的表達增加，給藥組表達量降低。ABEE可能是通過激活NF-κB信號通路從而實現(xiàn)肝臟保護的作用。基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9參與細胞的生長增殖、分裂、轉移等一系列過程，與肝纖維化有著密切的聯(lián)系，在單次注射CCl4造成急性肝損的模型中，MMP9表達增加，這與本實驗結果一致，與空白組相比，模型組MMP9表達量顯著增加，給藥組表達量降低，減少了肝細胞纖維化。

綜上所述Bcl-2、MYC、NF-κB1、RELA、MMP9這5 個靶點在細胞凋亡、增殖方面均發(fā)揮著至關重要的作用，CCl4所致小鼠急性肝損傷導致肝細胞氧化應激損害細胞膜和細胞器，激活細胞凋亡通路，NF-κB1、RELA表達水平的變化表明NF-κB通路被激活，進而影響細胞的凋亡與增殖。而給藥組Bcl-2的高表達可以抑制多種因素引起的細胞凋亡。CCl4造模后MYC、MMP9過度表達，進一步導致細胞凋亡增加，給藥組表達明顯降低。表明ABEE可能通過影響細胞凋亡和增殖起到肝臟保護作用。

KEGG通路富集結果發(fā)現(xiàn)Bcl-2、MYC、RELA、NF-κB1基因均為化學致癌-受體激活通路基因，表明ABEE可能是通過調(diào)節(jié)Bcl-2、MYC、NF-κB1、RELA的表達，從而調(diào)節(jié)化學致癌-受體激活通路的作用，從而實現(xiàn)肝臟保護作用，具體作用機制還需進一步驗證。

結論

本研究采用UPLC-MS/MS技術、網(wǎng)絡藥理學分析方法結合動物實驗驗證研究ABEE對CCl4致急性肝損傷小鼠的肝臟保護活性及作用機制。通過UPLC-MS/MS技術在正、負兩種離子模式下共鑒定篩選到ABEE中75 個化合物，其中主要化學成分種類包含脂肪酸、氨基酸和黃酮等。經(jīng)過網(wǎng)絡藥理學預測最終得到15 個化合物及其對應的11 個核心靶點。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)ABEE能夠有效改善肝臟病理組織形態(tài)，降低AST、ALT、AKP活力、提高小鼠抗氧化能力，采用實時PCR技術對上述預測11 個核心靶點進行驗證，結果顯示Bcl-2、MYC、MMP9、RELA、NF-κB1 mRNA顯著變化，進一步對這5 個基因采用Western blot法檢測蛋白表達水平，結果表明，蛋白水平發(fā)生了顯著變化。推測可能是水楊酸、棕櫚酸、α-亞麻酸、白楊素通過影響B(tài)cl-2、MYC、MMP9、RELA、NF-κB1的表達水平從而發(fā)揮肝臟保護的作用。采用網(wǎng)絡藥理學預測結合動物實驗驗證的方法，探究ABEE肝臟保護作用，結果顯示ABEE可能是通過多組分、多靶點協(xié)同作用實現(xiàn)對肝臟的保護作用，這為進一步探究雙孢菇的肝臟保護作用機制奠定了堅實的基礎，為雙孢菇的開發(fā)利用提供了新的方向，后續(xù)可對其相關的作用通路進行深入驗證，降低臨床藥物開發(fā)成本。

作者簡介

通信作者：

何紅平，男，博士，研究員，博士研究生導師。云南省省委聯(lián)系專家，云南省政府津貼獲得者，云南省中青年學術和技術帶頭人。香港科技大學訪問學者，美國亞利桑那大學博士后。主要從事藥物化學、中藥化學、民族藥等教學和科研工作，共發(fā)表SCI論文250余篇，以第一作者和通訊作者發(fā)表SCI論文70多篇。獲發(fā)明專利授權23件（包括2件美國專利）。先后主持過各類科研項目19項，包括國家自然科學基金項目5項，并以主要人員參加科技部重大專項、973、863和國家自然科學基金重點項目、云南省自然科學基金重點項目等項目。2014年獲云南省科學技術自然科學一等獎（排名第2）；2011年獲云南省科學技術自然科學三等獎（排名第1）；2010年獲云南省科學技術自然科學一等獎（排名第3）；2004年獲云南省科學技術自然科學一等獎（排名第6）。

第一作者：

王杰，男，云南中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院民族藥學專業(yè)碩士研究生，主要研究方向為民族藥物質(zhì)基礎及應用研究。

本文《基于網(wǎng)絡藥理學探究雙孢菇的肝臟保護作用》來源于《食品科學》2025年46卷第2期126-137頁，作者：王 杰，王金梅，劉 慧，劉旭光，郭文靜，何紅平。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240614-096。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：南伊；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

為貫徹落實《中共中央國務院關于全面推進美麗中國建設的意見》《關于建設美麗中國先行區(qū)的實施意見》和“健康中國2030”國家戰(zhàn)略，全面加強農(nóng)業(yè)農(nóng)村生態(tài)環(huán)境保護，推進美麗鄉(xiāng)村建設，加快農(nóng)產(chǎn)品加工與儲運產(chǎn)業(yè)發(fā)展，實現(xiàn)食品產(chǎn)業(yè)在生產(chǎn)方式、技術創(chuàng)新、環(huán)境保護等方面的全面升級。由 中國工程院主辦， 中國工程院環(huán)境與輕紡工程學部、北京食品科學研究院、湖南省農(nóng)業(yè)科學院承辦， 國際食品科技聯(lián)盟（IUFoST）、國際谷物科技協(xié)會（ICC）、湖南省食品科學技術學會、洞庭實驗室、湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究所、中國食品雜志社、中國工程院Engineering編輯部、湖南大學、湖南農(nóng)業(yè)大學、中南林業(yè)科技大學、長沙理工大學、湘潭大學、湖南中醫(yī)藥大學協(xié)辦的“ 2025年中國工程院工程科技學術研討會—推進美麗鄉(xiāng)村建設-加快農(nóng)產(chǎn)品加工與儲運產(chǎn)業(yè)發(fā)展暨第十二屆食品科學國際年會”，將于2025年8月8-10日在中國 湖南 長沙召開。

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