保水性和嫩度是反映宰后肉品多汁性和咀嚼性的重要指標，關乎肉品的食用價值和經濟效益。宰后成熟是調控肉品質的關鍵環節。

鈣蛋白酶（Calpains）與細胞凋亡酶（Caspase）是公認的宰后成熟過程重要的蛋白水解酶。Ac-DEVD-CHO（N-acetyl-Asp-Glu-Val-Aspaldehyde）是一種基于Caspase-3底物識別基序的四肽（Asp-Glu-Val-Asp），其N端偶聯乙酰基（用于增強化學穩定性），C端偶聯醛基（用于不可逆地滅活Caspase-3），能夠有效抑制Caspase-3活性，并介導其引起的一系列細胞凋亡。

寧夏大學食品科學與工程學院的馬萌、馬佳榮、羅瑞明*等選取宰后灘羊后腿肌為研究對象，通過注射Caspase-3抑制劑DEVD影響肌肉組織內細胞凋亡的進程，通過分析4 ℃條件下不同成熟時間點肌肉pH值、水分分布、微觀結構、肌原纖維蛋白降解以及保水性和嫩度等相關指標變化情況，探究并闡釋宰后成熟過程Caspase-3對灘羊肉保水性和嫩度的影響機制，以期進一步為灘羊肉宰后貯藏過程嫩度和保水性關鍵技術研究提供參考，為改善灘羊肉嫩度、減少產品汁液流失提供新思路。

01

宰后成熟期間灘羊肉Caspase-3及Caspase-9活性變化

Caspase-3和Caspase-9是細胞凋亡反應中重要的兩種酶，可以表征細胞凋亡的發生。由圖1A可知，宰后0～96 h，對照組Caspase-3活性呈先上升后下降的趨勢，且顯著高于DEVD處理組（P＜0.05）。DEVD處理組Caspase-3活性呈現先下降后上升再下降的趨勢，在宰后6 h顯著降低了25.01%（P＜0.05），隨后至96 h迅速上升了29.55%，并達到最大活性。對照組Caspase-3活性變化趨勢與在牛肉及牦牛樣本中的研究結果一致，且DEVD處理組同樣抑制Caspase-3活性，但宰后初期趨勢不同，原因可能為動物種類不同造成Caspase-3活性受抑制程度不同，灘羊受抑制程度更高。由圖1B可知，對照組Caspase-9活性整體高于DEVD處理組，且在12 h達到最低活性（6.79 U），DEVD處理組Caspase-9活性在宰后0～24 h顯著下降了22.39%（P＜0.05）。造成這一結果的原因是DEVD抑制了細胞質中由氧化細胞色素c產生的凋亡體。宰后12～48 h，DEVD處理組Caspase-9活性始終顯著低于對照組（P＜0.05），隨著貯藏時間的延長，DEVD的抑制效果降低。氧化細胞色素c含量增加，引起Caspase級聯反應放大。最后，Caspase-9的活性增加。結果表明，抑制劑DEVD可能會在儲存過程中延遲Caspase級聯反應的過程，DEVD組的Caspase-3和Caspase-9水平達到最大值的時間晚于對照樣品，成功抑制了Caspase-3和Caspase-9活性。

02

宰后成熟期間灘羊肉pH值變化

如圖2所示，對照組pH值在宰后0～96 h內呈現顯著下降趨勢（P＜0.05），并在96 h時達到最低（pH 5.52），隨著成熟時間延長，pH值又有所回升，這是因為肌肉中積累的乳酸逐漸被消耗，微生物代謝產生堿性物質，蛋白質與脂肪氧化產生的醛類、酮類等造成pH值回升。DEVD處理組整體趨勢和對照組相似，宰后0～6 h，DEVD處理組略高于對照組，且pH值在24～48 h顯著低于對照組（P＜0.05）。DEVD處理組pH值于48 h提前達到最低（pH 5.50），隨后迅速回升。灘羊肉屠宰后早期pH值迅速下降可以促進肌漿蛋白變性和活性氧（ROS）積累，進一步加劇了線粒體功能障礙和細胞色素c氧化，從而激活Caspase-3改善肌肉嫩度。本實驗中，由于處理組抑制Caspase-3活性，宰后初期DEVD處理組pH值高于對照組，隨后pH值迅速下降并低于對照組，但最終pH值又大幅回升并超過處理組，最終結果是嫩化過程和死后凋亡過程減慢。

03

宰后成熟期間保水性指標變化

離心損失和蒸煮損失是肉品保水率的重要指標，與肉品多汁性高度相關。由圖3可知，宰后對照組和DEVD處理組離心損失率和蒸煮損失率整體均呈先上升后下降的趨勢（P＜0.05）。如圖3A所示，DEVD處理組在宰后6～96 h離心損失迅速上升并達到最大（18.79%），顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖3B所示，在宰后6～192 h，對照組和DEVD組蒸煮損失分別升高了6.13%和9.76%。此外，24～192 h對照組蒸煮損失顯著低于DEVD處理組（P＜0.05）。肌肉宰后成熟過程中pH值快速下降導致蛋白質變性是肌肉水分流失水平高的主要原因。本實驗中處理組pH值迅速下降造成水分的流失，結果表明宰后DEVD處理對灘羊肉保水性產生負面影響。

04

宰后成熟期間灘羊肉水分分布變化

為了進一步探究宰后Caspase-3是否對灘羊肉內部水分遷移以及水分分布狀態產生影響，采用無損且無創傷的低場核磁共振光譜進行檢測。通過觀察橫向弛豫時間變化評估宰后灘羊肉不同成熟時間段系水力。灘羊宰后成熟橫向弛豫時間變化如圖4所示，整個成熟過程灘羊肉橫向弛豫時間出現了3 個峰段特征起伏，分別為T21（0.1～10 ms）、T22（10～100 ms）和T23（100～1 000 ms）。其中T21所對應峰表征存在于灘羊肌肉組織中與分子緊密結合且不易流失的結合水；T22峰段表征在肌纖維網絡結構中束縛的不易流動水；T23峰段表征困在肌纖維束間包括肌漿蛋白在內的自由水。由圖4A可知，對照組不易流動水（T22）峰比例最高，且隨著灘羊肉的成熟逐漸呈現縮小趨勢，如圖4B所示，DEVD處理組T22處峰比例變化程度明顯高于對照組。結果表明，宰后DEVD處理灘羊肉系水力變差。

如圖5所示，整個成熟過程T21（結合水）受影響較小，對照組和DEVD處理組無明顯變化。T22處弛豫時間呈現下降趨勢，且DEVD處理組在T22下降趨勢較對照組明顯。T23處弛豫時間呈現顯著下降趨勢（P＜0.05），宰后6～192 h，DEVD處理組和對照組自由水含量分別降低了35.50%和47.24%。宰后肌肉pH值的變化與持水能力密切相關，由于處理組的pH值在宰后迅速下降，導致肌原纖維蛋白和肌漿蛋白變性，減小了肌原纖維內空間，肌原纖維內水被輸送到肌原纖維外，從而導致水分損失增加。宰后肌肉組織的水分逐漸遷移主要以自由水和不易流動水的形式流失，且DEVD處理灘羊肉保水性變差。綜上，隨著宰后灘羊肉的成熟，Caspase-3通過影響肌肉內部水分分布及遷移，進而調控灘羊肉保水性。

05

宰后成熟期間灘羊肉MFI變化

宰后成熟過程，隨著肌肉內環境條件的改變，在Caspase和Calpains等的共同作用下，細胞凋亡級聯反應發生，肌纖維斷裂發生小片化，肉的嫩度得到改善。如圖6所示，宰后0～192 h，對照組和DEVD處理組MFI呈現逐漸上升趨勢，且DEVD處理組的上升趨勢顯著低于對照組（P＜0.05），與其他研究的趨勢相同，DEVD處理組顯著降低了MFI。對照組在48 h時MFI達到了DEVD處理組的1.30 倍。整個成熟階段對照組MFI顯著增大了82.92，DEVD組MFI顯著上升了26.27。Caspase抑制劑在宰后早期的嫩化成熟過程中起著重要作用，當Caspase被抑制時，即使其他內源酶能發揮降解作用，嫩化效果也明顯下降。因此，Caspase-3和其他內源性嫩化因子之間的關系可能依賴于凋亡相關酶。表明在存在其他內源性酶的情況下，抑制Caspase-3也會導致嫩化過程和死后衰老過程減慢。

06

宰后成熟期間灘羊肉剪切力的變化

剪切力對衡量肉品嫩度變化有重要意義，較低剪切力的肉品具有較好的嫩度口感。如圖7所示，宰后6～192 h對照組和DEVD處理組剪切力變化趨向一致，呈現先顯著上升后顯著下降趨勢（P＜0.05）。DEVD處理組剪切力在整個成熟階段均顯著高于對照組（P＜0.05），并于48 h時達到最大剪切力（35.29 N），為對照組的1.42 倍。宰后6～48 h，對照組剪切力顯著上升了35.33%（P＜0.05），而DEVD處理組剪切力顯著上升了39.3%（P＜0.05）。這些結果表明，Caspase-3抑制劑減弱了細胞凋亡過程，抑制了肌肉的軟化。由此可見，宰后成熟DEVD處理不利于灘羊肉嫩化。

07

宰后成熟期間灘羊肉肌纖維蛋白降解情況

肌鈣蛋白-T作為蛋白質降解的標志產物，與肉品嫩度和持水性密切相關，其特征降解片段通常在30 kDa處出現，為了進一步明確宰后Caspase對灘羊肉保水性和嫩度的影響機制，對灘羊肉內部肌原纖維蛋白降解情況進行測定。由圖8A可知，隨著宰后成熟，蛋白條帶降解產物不斷增多。值得關注的是，宰后24 h對照組出現少量30 kDa片段降解產物，此時也是對照組MFI大幅上升的開始，說明肌鈣蛋白-T的消失與宰后衰老中肉的嫩度密切相關。如圖8C所示，DEVD處理組宰后前期降解整體少于對照組，在96 h后大量降解，隨著成熟時間延長降解片段逐漸增多，且96 h灰度值明顯高于對照組，說明宰后前期DEVD起作用，抑制了肌原纖維蛋白降解。宰后后期隨著DEVD的作用減弱，肌原纖維蛋白降解速率加快。因此，本研究中對照組肌鈣蛋白-T的顯著降解表明宰后48 h后具有強持水能力。

MHC是肌肉中的主要結構和功能蛋白，負責骨骼肌的結構完整性，參與肌肉收縮和松弛。如圖8B所示，對照組在宰后6 h MHC降解高于處理組（P＜0.05），這也解釋了對照組的高嫩度，宰后后期對照組和處理組MHC降解程度于12～24 h先上升，48 h開始下降，表明肌肉成熟期間MHC降解逐步減少。綜上，隨著宰后成熟進行，Caspase通過影響肌鈣蛋白-T和MHC降解調控灘羊肉保水性和嫩度的改變。

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宰后成熟期間灘羊肉微觀結構變化情況

如圖9所示，宰后0 h空白組肌纖維結構完整，肌纖維間排列致密。宰后6 h對照組和DEVD處理組肌纖維結構較完整、排列整齊，均呈現規則的暗帶和明帶。宰后24～192 h對照組肌原纖維斷裂程度逐漸加劇，肌纖維之間逐漸產生較大的縫隙，且肌纖維明帶出現明顯的斷裂，Z帶結構逐漸模糊。值得注意的是，DEVD處理組在宰后24 h肌纖維斷裂現象較對照組明顯滯后，肌纖維結構相對比較完整，此外，肌節之間可以觀察到明顯的細胞液溢出現象。宰后48 h，DEVD處理組肌原纖維之間才逐漸出現小片化斷裂，且隨著成熟時間延長，小片化程度逐漸加劇，呈現不規則形狀，肌原纖維彼此之間呈現較大的空隙，肌纖維結構變得松散。表明宰后成熟過程，Caspase干預肌原纖維蛋白降解，使得肌原纖維從肌膜脫落，隨著降解程度加劇，形成多且寬的可供水分流出的滴水通道。

09

Caspase-3作為重要的凋亡效應酶，它的激活是細胞凋亡發生的重要標志。本研究通過注射Caspase-3抑制劑AC-DEVD-CHO，發現宰后成熟前期（0～24 h），處理組Caspase-3活性相較于對照組顯著降低，隨后迅速回升，可能是由于宰后前期抑制劑起作用，抑制了酶活性，隨著成熟時間延長，pH值迅速降低，抑制劑的抑制效果逐漸減弱，酶活性短暫性迅速回升。本研究發現，與對照組相比，抑制Caspase-3活性，Caspase-9活性也會隨之降低，原因可能是宰后成熟過程線粒體通過直接釋放凋亡誘導因子（AIF）激活下游的細胞凋亡級聯反應發生，在細胞質中AIF直接引發Caspase-3激活，繼而活化Caspase-9。

宰后成熟過程中肌肉內部酶活性變化與pH值變化引發的肌肉內環境酸化有關，肉的保水性也因此而改變。本研究結果顯示，隨著宰后成熟時間的延長，pH值迅速下降，DEVD處理組在48 h時，pH值顯著低于對照組并達到極值（P＜0.05）。與此同時，DEVD處理組蒸煮損失率和離心損失率在宰后6～12 h與對照組差異不明顯，隨后在宰后24 h后顯著高于對照組（P＜0.05），表明宰后前期（6～12 h）DEVD處理對灘羊肉保水性影響不大，而宰后后期24～192 h保水性明顯變差。總地來說，DEVD處理通過使宰后前期pH值下降更快及后期pH值更低，對肌肉保水性造成不利影響。

嫩度是反映灘羊肉品質的重要指標，食品檢測中常用剪切力和MFI表征嫩度。本研究結果表明，宰后剪切力呈現先上升后下降趨勢，且在48 h達到最大剪切力。推測宰后肌肉在48 h時肌肉處于僵直期，隨著pH值急速下降，肌肉在一系列內源酶作用下解僵，同時發生肌纖維小片化，因而MFI呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。說明宰后肌原纖維不斷降解，肉的嫩度得到改善。此前研究發現宰后牛肉嫩度和細胞凋亡酶之間顯著相關。在本研究中，對照組和AC-DEVD-CHO組之間的剪切力在宰后立即開始產生明顯的差異。ACDEVD-CHO組的剪切力顯著高于對照組，而MFI低于對照組，表明其不利于肌肉嫩度。

肌纖維降解是嫩度改善和保水性變化的重要原因。本研究通過SDS-PAGE分析發現在宰后12 h對照組在30 kDa出現肌鈣蛋白-T特征降解片段，隨著成熟時間延長，在12～96 h對照組灰度值先增大后減小（P＜0.05），值得注意的是，DEVD處理組30 kDa處降解片段少于對照組，在48～192 h，灰度值顯著上升（P＜0.05），說明宰后前期（0～24h）DEVD發揮作用，抑制肌鈣蛋白-T降解，導致保水性變差，同時也不利于嫩度。

為了進一步探究宰后凋亡效應酶對肌肉微觀結構的影響，本研究同時采用透射電鏡進行觀察。發現宰后成熟6 h，灘羊肉肌原纖維結構相對比較完整，且肌原纖維與肌原纖維之間結合緊密，Z線清晰，排列有序，結合pH值結果，認為此時肌肉逐漸進入僵直期。宰后6～48 h，DEVD處理組由于氧化應激，肌肉迅速收縮，肌細胞在外力作用下持水力不足，導致細胞間水分被擠出在胞漿而流失，因此保水性和嫩度較對照組差。綜上結果，證明宰后早期肌肉成熟過程DEVD通過抑制Caspase-3活性，阻礙細胞凋亡發生，延長了細胞進入僵直期的進程，由于氧化應激等原因，肌肉收縮胞漿溢出，肉的持水性能和嫩度變差。宰后后期，DEVD作用減弱，隨著Caspase-3活化，細胞骨架蛋白被降解，剪切力降低，嫩度改善，而持水性也隨著肌原纖維的不斷降解持續下降，保水性變差。

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結 論

本研究通過測定灘羊肉宰后成熟期Caspase活性、保水性和嫩度指標變化，發現宰后成熟期間灘羊肉MFI呈現上升趨勢；pH值、Caspase-9活性呈現先下降后上升趨勢；剪切力、蒸煮損失、離心損失和Caspase-3活性呈現先上升后下降趨勢；肌原纖維降解產物呈現先減少后逐漸增多趨勢。本研究發現，在宰后前期，DEVD通過抑制Caspase-3活性，保護肌原纖維完整性，減速細胞凋亡進程，降低肌原纖維降解程度，影響肌肉水分的分布，致使保水性和嫩度變差；宰后后期，隨著pH值的回升，DEVD作用減弱，Caspase-3迅速活化，伴隨肌原纖維蛋白的降解發生，肌肉嫩度得到改善，與此同時肌原纖維小片化加劇，肌肉結構崩塌，肌纖維間形成較大的縫隙，水分流失，灘羊肉保水性變差。本研究結果驗證了Caspase-3對宰后灘羊肉肉品嫩度的改善和保水性提升具有重要影響，并闡明了其作用機理，可為宰后灘羊肉貯藏汁液流失控制及肉的嫩化形成方面研究提供理論依據。

本文《宰后成熟期間細胞凋亡酶-3抑制劑對灘羊肉保水性及嫩度的影響》來源于《食品科學》2025年46卷第5期96-105頁，作者：馬萌，馬佳榮，高爽，梁燕群，羅瑞明。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240805-033。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：李雄；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

為貫徹落實《中共中央國務院關于全面推進美麗中國建設的意見》《關于建設美麗中國先行區的實施意見》和“健康中國2030”國家戰略，全面加強農業農村生態環境保護，推進美麗鄉村建設，加快農產品加工與儲運產業發展，實現食品產業在生產方式、技術創新、環境保護等方面的全面升級。由 中國工程院主辦， 中國工程院環境與輕紡工程學部、北京食品科學研究院、湖南省農業科學院承辦， 國際食品科技聯盟（IUFoST）、國際谷物科技協會（ICC）、湖南省食品科學技術學會、洞庭實驗室、湖南省農產品加工與質量安全研究所、中國食品雜志社、中國工程院Engineering編輯部、湖南大學、湖南農業大學、中南林業科技大學、長沙理工大學、湘潭大學、湖南中醫藥大學協辦的“ 2025年中國工程院工程科技學術研討會—推進美麗鄉村建設-加快農產品加工與儲運產業發展暨第十二屆食品科學國際年會”，將于2025年8月8-10日在中國 湖南 長沙召開。

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