靶向CD3激活T細(xì)胞的TCE雙抗已經(jīng)有多款藥物獲批上市，包括血液瘤和實(shí)體瘤，并且開始向自免領(lǐng)域拓展，對(duì)于這類雙抗，CRS風(fēng)險(xiǎn)是無法逃避的一個(gè)問題，目前臨床中通常采用step dose的策略降低CRS風(fēng)險(xiǎn)--在首次給藥時(shí)進(jìn)行低劑量給藥，后續(xù)再進(jìn)行高劑量或者全劑量給藥。首次較低的雖然可以產(chǎn)生CRS，但是因?yàn)閯┝枯^低，因此其風(fēng)險(xiǎn)可控，而后續(xù)高劑量給藥通常CRS風(fēng)險(xiǎn)較低。該策略可以有效的降低TCE的CRS風(fēng)險(xiǎn)，但是其背后的深層次原理目前還不清除，最近，來自于諾華的研究者對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了研究。

諾華團(tuán)隊(duì)的研究策略如下圖所示，在Day1進(jìn)行RTCC(Redirected T cell cytotoxicity)鋪板并進(jìn)行雙抗刺激，然后在Day2進(jìn)行流式分析并檢測(cè)細(xì)胞因子，刺激后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)并在Day5再進(jìn)行RTCC鋪板和刺激，刺激后3小時(shí)進(jìn)行CITE-seq(transcriptomes and epitopes by sequencing: 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+表面蛋白測(cè)序技術(shù))分析，并再次進(jìn)行流式分析及細(xì)胞因子檢測(cè)。對(duì)于CITE-seq分析，其樣品來源如下圖B所示，Day1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行分析，T細(xì)胞培養(yǎng)后，Day5每組繼續(xù)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行樣品分析。該研究主要就是方案設(shè)計(jì)及CITE-seq分析。

首先是方法驗(yàn)證，證明上述的設(shè)計(jì)方案能夠重復(fù)體內(nèi)的現(xiàn)象，首次給藥能刺激多種細(xì)胞因子并形成CRS，后續(xù)給藥在不影響殺傷活性的前提下，CRS相關(guān)細(xì)胞因子分泌降低。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+表面蛋白測(cè)序技術(shù)聚類分析發(fā)現(xiàn)，在雙抗首次刺激后，有兩個(gè)特征鮮明的T細(xì)胞亞群：高表達(dá)細(xì)胞因子基因的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）群體，以及呈現(xiàn)"低細(xì)胞毒性-高溶細(xì)胞活性"特征的CTL_low群體——該群體高表達(dá)顆粒酶B（GZMB編碼）和穿孔素（PRF1編碼）等溶細(xì)胞相關(guān)基因，但TNF-α（TNF編碼）和IFN-γ（IFNG編碼）等細(xì)胞因子表達(dá)水平相對(duì)較低（下圖B）

此外，研究鑒定出一個(gè)數(shù)量龐大的CD8+中央記憶T細(xì)胞（CD8_Tcm_TCF7）群體，其特征表現(xiàn)為：1）高表達(dá)TCF7基因（編碼維持CD8+T細(xì)胞干性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TCF1）和CARS基因（編碼線粒體功能相關(guān)的胱氨酸-tRNA合成酶1）（下圖B）；2）表面標(biāo)志物呈現(xiàn)CD62L高表達(dá)和CD45RA低表達(dá)模式，符合經(jīng)典中央記憶表型特征。

基于治療分組的UMAP分析顯示，在既往接受治療的樣本中存在多個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞簇（圖4A）。其中，CD8_Tcm_TCF7細(xì)胞群僅存在于治療后的樣本中，而這些樣本中初始T細(xì)胞（Tn）的比例顯著降低。二次BSP（TCE）治療后，CD8_Tcm_TCF7細(xì)胞群急劇減少，同時(shí)出現(xiàn)以下新群體：1）CD8_CTL_low（低細(xì)胞毒性T細(xì)胞）；2）CD8_activated（活化CD8+T細(xì)胞）；3）CD8_stem_TCF7（干細(xì)胞樣CD8+T細(xì)胞）——該群體雖保留TCF7等基因特征，但額外高表達(dá)CCR7（歸巢受體）、BCL3（抗凋亡因子）和BAFF（B細(xì)胞活化因子），提示其具有干細(xì)胞樣表型；4）雙標(biāo)細(xì)胞群（同時(shí)表達(dá)T/B細(xì)胞標(biāo)記物），可能通過形成非經(jīng)典免疫突觸介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用（圖4A）。

在首次BSP治療中，細(xì)胞因子基因TNF主要由CTL細(xì)胞群分泌（圖4B）；而二次治療后，CTL群體幾乎消失，取而代之的是獨(dú)特的CD8_CTL_low群體——該群體呈現(xiàn)GZMB高表達(dá)但TNF低表達(dá)的特征（圖4B）。與CTL相比，CD8_CTL_low群體中顯著上調(diào)的基因包括溶細(xì)胞基因（GZMB、PRF1）、共刺激受體4-1BB以及T細(xì)胞分化關(guān)鍵調(diào)控因子BATF；而下調(diào)基因則涉及細(xì)胞因子相關(guān)基因、活化標(biāo)志物CD69和促進(jìn)T細(xì)胞耗竭的轉(zhuǎn)錄因子NR4A1（圖4C）。這些數(shù)據(jù)揭示了CD8_CTL_low與CTL群體間溶細(xì)胞活性基因與細(xì)胞因子基因表達(dá)平衡的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變（圖4C）。

細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）群體的不同暗示，首次給藥和二次給藥后刺激的細(xì)胞群體不同，通路分析顯示，上調(diào)基因在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、粘附、能量代謝及氧化磷酸化等相關(guān)通路中顯著富集。綜合這些結(jié)果提示，CD8_Tcm_TCF7細(xì)胞群同時(shí)具備早期譜系細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的獨(dú)特特征，其線粒體功能增強(qiáng)可能導(dǎo)致了細(xì)胞溶解活性提升而細(xì)胞因子分泌減少的獨(dú)特表型。

后續(xù)，研究團(tuán)隊(duì)證明達(dá)沙替尼治療抑制初始T細(xì)胞活性，但不影響后續(xù)給藥后藥物活性，也就是說，T細(xì)胞細(xì)胞因子釋放和藥效是可以解偶聯(lián)的，這也為后續(xù)TCE治療解決細(xì)胞因子提供了新的方案。

總結(jié)

初始低劑量給藥主要激活了CD8效應(yīng)記憶T細(xì)胞（Tem）作為效應(yīng)細(xì)胞，而后續(xù)給藥則利用了高表達(dá)TCF7的新型中央記憶CD8+T細(xì)胞（CD8-Tcm-TCF7）作為效應(yīng)細(xì)胞。另外，本研究表明，TCE雙抗還能激活（啟動(dòng)）Tn細(xì)胞等其他T細(xì)胞亞群。雖然Tn細(xì)胞的激活不會(huì)導(dǎo)致高水平的細(xì)胞溶解相關(guān)基因或細(xì)胞因子表達(dá)，但很可能啟動(dòng)了其向高表達(dá)TCF7的新型中央記憶細(xì)胞分化。與Ferreira等報(bào)道的結(jié)果一致：CD8+/TCF7+細(xì)胞類似Tcm細(xì)胞，由被啟動(dòng)的Tn細(xì)胞分化而來，經(jīng)后續(xù)刺激可發(fā)展為具有細(xì)胞溶解功能的效應(yīng)細(xì)胞。

另外值得注意的是，該研究也證明，T細(xì)胞細(xì)胞因子釋放和藥效是可以解偶聯(lián)的，這也為后續(xù)TCE治療解決細(xì)胞因子提供了新的方案。

參考文獻(xiàn)：doi.org/10.1016/j.biopha.2025.117973

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