摘要：在再生醫學、細胞治療和個性化醫療的發展進程中，優化的細胞培養基至關重要。傳統培養基如 Eagle's MEM 和 DMEM 雖推動了基礎研究，但主要為非人類細胞設計，無法滿足人類細胞獨特的代謝和功能需求。本文回顧了細胞培養基的發展歷程，剖析了在可重復性、可擴展性及倫理方面的持續挑戰，尤其是對動物來源成分（如胎牛血清）的依賴問題。文中重點介紹了無血清和化學成分確定培養基的創新成果，這些成果通過提高一致性、符合良好生產規范及解決倫理問題，為細胞培養提供了有前景的替代方案。同時，探討了基于組學的分析、高通量篩選和人工智能驅動的培養基設計等新興方法，這些方法正通過精準適配特定人類細胞類型和患者來源細胞的需求，重塑培養基優化模式。此外，還討論了經濟和監管方面的挑戰，強調需要經濟高效且可擴展的解決方案以促進臨床轉化。展望未來，整合 3D 生物打印、器官芯片系統和個性化培養基配方等先進生物技術，為人類細胞培養帶來了變革性機遇，這些創新符合倫理和臨床標準，能推動人類特異性培養基系統的發展，確保可重復性、可擴展性并增強治療潛力，從而推動研究和臨床應用的進步。一、引言：細胞培養基的發展與挑戰1.1 傳統培養基的里程碑與局限

Eagle's Minimum Essential Medium（MEM）和 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）的問世是細胞生物學和組織培養領域的重要里程碑，為體外培養人類和動物細胞提供了基礎，極大地推動了生物醫學研究。然而，這些培養基的設計主要基于嚙齒類動物的代謝特征，與人類細胞存在生理不匹配。例如，人類血漿中不存在尿酸，但經典培養基中普遍含有尿酸，這會抑制人類細胞中的核苷酸生物合成。這種不匹配在 CAR-T 細胞等治療應用中尤為明顯，次優的培養基會導致 T 細胞耗竭和功能變異。

1.2 向人類特異性培養基的轉變

20 世紀 70 年代推出的 L-15 培養基是向人類特異性細胞培養轉變的關鍵一步，它專門為原代人類成纖維細胞設計。20 世紀 80 年代，Iscove's IMDM 取得了重要進展，它用轉鐵蛋白/白蛋白替代血清，適用于造血細胞。然而，這些突破在當時仍屬小眾，大多數領域仍依賴 DMEM/RPMI 配方，而這些配方并不適合人類細胞較低的抗氧化能力和獨特的營養吸收模式。長期以來，人類細胞特異性培養基的研究未得到充分探索，許多研究人員依賴動物來源配方的改編，未能充分考慮物種間的顯著代謝差異。

1.3 無血清和化學成分確定培養基的興起

無血清和化學成分確定培養基（CDM）的創新為人類細胞培養提供了更合適的解決方案，它們通過去除動物來源成分，提高了一致性、可擴展性并解決了倫理問題。例如，設計用于維持干細胞多能性和功能的無血清培養基在減少變異性的同時，降低了與動物來源產品相關的污染風險。盡管無血清培養基降低了批次間的變異性，但其成本仍然過高。例如，人類血小板裂解液（HPL）可增強間充質干細胞（MSC）的擴增，但會引入依賴供體的細胞因子，從而影響免疫調節譜，這一權衡在轉化研究中常被忽視。

二、人類細胞培養基的優化：現狀與挑戰2.1 人類細胞的代謝和功能多樣性

人類細胞表現出不同的代謝和功能需求，這需要定制化的培養基配方，而通用培養基的開發受到人類細胞類型獨特需求的阻礙。例如，干細胞（包括誘導多能干細胞（iPSCs）和胚胎干細胞（ESCs））依賴基本成纖維細胞生長因子（bFGF）和轉化生長因子 -β（TGF-β）等生長因子來維持多能性和自我更新。這些細胞的培養基配方必須確保營養和信號分子的正確平衡，以防止分化并促進細胞增殖。表 1總結了市售培養基的關鍵信息，強調了它們在支持特定人類細胞類型方面的優缺點。干細胞培養基如 mTeSR?1 和 Essential 8?是無動物成分配方的典范，它們用胰島素和白蛋白等確定成分替代血清，在解決倫理問題的同時維持多能性。

免疫細胞如 T 細胞和自然殺傷（NK）細胞需要細胞因子（如 IL-2、IL-15）來維持活化和增殖，這與干細胞的生長因子需求形成鮮明對比。這種多樣性延伸到治療應用中，次優的培養基會影響 CAR-T 細胞的療效或干細胞的分化。例如，補充 HPL 的無血清培養基可增強 NK 細胞的擴增并保持其功能。間充質干細胞（MSCs）進一步說明了這種多樣性，在無血清條件下，自體血漿可提高 MSC 的生長速率，而活化 T 細胞的代謝從氧化磷酸化轉向糖酵解，這凸顯了對富含葡萄糖配方的需求。這些例子強調了針對特定細胞類型優化培養基的必要性，以滿足其獨特的營養利用模式。

2.2 市售培養基的成分分析

由于有數百種可用的培養基成分和各細胞系的獨特要求，市售培養基的成分差異很大。對市售培養基的比較評估了培養基之間的變異性和對特定細胞培養的適用性。我們回顧了 48 種常用于人類細胞培養的商業培養基和補充劑，其中只有 25 種提供了詳細的成分信息（表 2）。在這些已知成分的培養基中，13 種是基礎培養基（需要補充血清或其他添加劑以實現最佳細胞生長的配方），1 種是低血清培養基（需要減少血清補充的基礎培養基），8 種是無血清培養基（不需要血清補充的完整培養基），3 種是血清替代補充劑（旨在模擬血清的配方）。盡管人類細胞系可能有不同的營養需求，但 9 種基礎培養基對應經典培養基配方，這些配方也更廣泛地用于哺乳動物和昆蟲細胞培養。因此，像 DMEM 和 RPMI-1640 這樣的經典培養基未能滿足人類細胞的細致需求。

對 25 種商業培養基的分析表明，基礎配方缺乏關鍵的人類特異性成分。例如，IMDM 和 Neurobasal Medium 包含 HEPES 用于 pH 緩沖，但省略了硒等微量元素，而硒對干細胞的存活至關重要。在成分比較中，總共鑒定出 159 種成分，其中超過 50% 的成分被鑒定為微量元素、氨基酸和無機鹽（圖 1），成分根據培養基配方提供的類別進行分類。最常見的成分包括氨基酸（包括所有必需氨基酸）、葡萄糖、維生素（B 族、膽堿和生物素）和無機鹽（鈣、鉀、鎂和鈉）。占成分 24.5% 的 “其他” 類別作為不常出現的成分或分組的統稱，例如，它包括非營養成分如酚紅（一種常見的 pH 指示劑）和 HEPES（一種緩沖劑）以及胸苷等核苷。

2.3 血清依賴的局限性與倫理挑戰

胎牛血清（FBS）由于其富含生長因子和營養物質，仍然是細胞培養的基石。然而，FBS 的批次間變異性和污染風險破壞了實驗的可重復性和臨床安全性。FBS 的不確定性進一步加劇了這些問題，它含有未知的細胞因子、生長因子和性激素，會不一致地影響細胞行為。

FBS 中存在的性激素，如雌激素和睪酮，會在細胞反應中引入性別特異性偏差。例如，含血清培養基中生理水平的雌激素會改變工程腎臟模型中腎小管細胞的代謝和藥物反應，凸顯了性激素對體外系統的未被充分認識的影響。這種變異性使數據解釋復雜化，并降低了轉化相關性，尤其是在個性化醫療應用中。

HPL 和 CDM 已成為替代方案，提供了更好的一致性并減少了倫理問題。CDM 具有完全表征的成分，消除了動物來源的污染物和性激素，符合 GMP 用于臨床應用。然而，CDM 的開發面臨著在復制血清的生長促進復雜性的同時保持成本效益的挑戰。

2.4 監管與經濟挑戰

新的人類細胞培養基的開發受到嚴格的監管審查，特別是來自美國食品和藥物管理局（FDA）等機構。例如，2021 年，FDA 發布了行業指南《人類基因治療研究性新藥申請的化學、制造和控制（CMC）信息》，該指南強調了所有成分的詳細表征的必要性，包括細胞培養基（FDA Q8 (R2)）。全球范圍內，歐洲藥品管理局（EMA）和日本藥品和醫療器械管理局（PMDA）等監管機構與 FDA 標準保持一致。人用藥品技術要求國際協調會議（ICH）Q5D（用于生產生物技術/生物制品的細胞基質的衍生和表征）等協調指南的使用，凸顯了全球對培養基成分的審查，這主要集中在確保這些培養基配方的安全性和有效性，特別是用于基于細胞的治療等臨床應用。每種新的培養基配方必須經過全面的驗證過程，包括一致性、無菌性和維持細胞健康和行為的功能評估等嚴格測試。

一個關鍵的監管驅動因素是轉向無血清和 CDM，這解決了動物來源成分固有的批次變異性。例如，CDM 在 CHO 細胞生物加工中表現出優異的一致性，將單克隆抗體產量提高了 30-50%，同時滿足了 FDA 規定的可重復性閾值。監管機構優先考慮符合 GMP 的配方，要求對原材料來源、制造過程和質量控制協議進行完整記錄。FDA 已經制定了專門針對人類細胞產品的制造和質量控制評估的指南，進一步強調了在細胞培養基開發中遵守監管標準的重要性。

轉向符合 GMP 的人類細胞培養基通過嚴格的制造標準和嚴格的質量控制措施（如無菌和支原體檢測）顯著提高了可重復性。這些培養基消除了血清基配方中不確定成分的可變性，從而提高了實驗和臨床結果的可靠性。例如，與非 GMP 替代品相比，符合 GMP 的無動物成分培養基已被證明能維持 MSC 的分化潛力和免疫表型，同時支持更高的增殖率。然而，由于需要原材料可追溯性、廣泛的驗證以及遵守 ISO 13485 和 FDA 21 CFR Part 820 等監管框架，符合 GMP 的培養基成本高出 2-5 倍。盡管有這些前期費用，但長期利益包括減少批次失敗、簡化監管批準以及改善治療制造的可擴展性。研究表明，GMP 培養基的可靠性和一致性通過最大限度地降低污染風險和確保符合臨床標準，抵消了其較高的成本，使其成為基于細胞的治療和再生醫學的必不可少的。

三、培養基優化的創新方法3.1 水解物作為復雜培養基成分

水解物是通過蛋白質的酶消化獲得的，作為人類細胞培養基補充劑的潛力在于它們能夠提供肽、氨基酸和代謝物的復雜混合物。最近的研究，包括基于 NMR 的代謝組學分析，已經開始系統地表征水解物的代謝物組成，揭示了變異性，但也為在人類細胞培養系統中定制其使用提供了重要機會。例如，酵母來源的水解物含有高濃度的必需氨基酸和核苷，這對支持體外人類細胞的代謝需求至關重要。這些見解強調了水解物在減輕批次間變異性的同時，為完全確定的培養基提供經濟有效的替代方案的潛力。

雖然關于水解物的基礎研究主要集中在動物細胞系統，但這些發現為其適應人類特異性應用提供了基礎。例如，亞麻籽蛋白水解物已被證明能提高 CHO 細胞培養中的活細胞密度和重組蛋白滴度，而大豆蛋白水解物則改善了哺乳動物系統中的 IgG 生產。然而，將這些益處轉化為人類細胞需要優化以適應物種特異性代謝途徑和功能需求。水解物的促生長特性歸因于它們的肽譜，這可能滿足不同人類細胞類型的營養需求，盡管這需要嚴格的驗證。

例如，源自牛骨膠原水解物的肽已被證明與表皮生長因子受體（EGFR）相互作用，促進成骨細胞增殖并調節細胞周期進程。類似地，在植物蛋白基飲食中補充水解物已被發現能增強斑節對蝦等水生物種的生長性能，強調了水解物混合物影響生長因子類似物的潛力。此外，對 CHO 細胞培養的研究已經證明了肽水解物的生物活性，突出了它們改善細胞生長和生產力的能力。除了促進生長外，水解物還表現出抗應激作用，這是人類細胞培養中的一個關鍵挑戰。研究表明，燕麥麩蛋白水解物和魚蛋白水解物分別減輕了肝細胞和上皮細胞系中的氧化損傷，表明它們與人類特異性應用的相關性。這種抗氧化活性在培養誘導的應激下保護細胞活力和功能特別有價值，使水解物成為多功能添加劑。

3.2 高通量篩選與自動化

高通量篩選（HTS）在細胞培養基優化中的主要優勢之一是其能夠同時篩選大量培養基成分庫。例如，集成機器人系統用于高通量工藝開發的實用性，可應用于篩選細胞培養基成分并評估其毒性。這種方法允許識別增強細胞生產力同時最大限度減少血清使用的補充劑，這對降低成本和提高細胞培養的可重復性至關重要。此外，HTS 系統的模塊化便于細胞類型和培養基成分的平行篩選。一種可容納 3D 人類神經祖細胞培養的微陣列芯片平臺，展示了針對特定細胞類型的培養基配方進行高通量篩選的潛力。這種能力對于開發支持復雜細胞行為和相互作用的培養基至關重要，尤其是在更好地模擬體內環境的 3D 培養中。

微流體技術的集成進一步提高了培養基優化的效率。例如，使用微工程類器官芯片系統，允許控制培養條件和精確操作培養基成分，使研究人員能夠更準確地預測細胞反應。這些平臺可用于系統地改變培養基成分并評估其對細胞活力和功能的影響，從而簡化優化過程。除了識別最佳培養基配方外，HTS 技術在理解培養基成分和細胞反應之間的相互作用方面也發揮著關鍵作用。高通量篩選技術的原理可用于評估各種培養基對細胞行為的影響，這可能導致發現增強細胞性能的新型培養條件。這種方法允許同時評估多個參數，如細胞形態、增殖率和代謝活性，提供關于培養基成分如何影響細胞結果的全面理解。

3.3 組學技術的整合

組學驅動框架的整合通過實現針對特定細胞需求的精確、數據驅動的培養基配方優化，顯著改變了人類細胞培養基的開發。轉錄組學通過識別不同培養基條件下的基因表達變化發揮了關鍵作用，從而指導營養成分的調整以支持最佳細胞功能。例如，轉錄組學和合成生物學方法發現，胰島素樣生長因子結合蛋白 - 4（IGFBP-4）和水通道蛋白 1（AQP1）等基因的功能性缺失對細胞適應無血清懸浮培養至關重要。這些發現促進了支持 CHO 細胞用于生物制藥生產的培養基的設計。表觀遺傳學研究進一步強調了在敏感細胞類型（如人類胚胎和多能干細胞）中維持基因組完整性的重要性。培養基配方必須最大限度地減少 DNA 甲基化變化和組蛋白修飾，這對長期培養中保持細胞功能和穩定性至關重要。此外，表觀遺傳建模已成為維持細胞身份和驅動細胞轉化的強大工具，像 EpiMOGRIFY 這樣的平臺利用表觀基因組數據來預測可擴展細胞治療制造的最佳培養條件。這些發現強調了對化學成分確定的無血清培養基的需求，以確保再生醫學和生物制造中的可重復性。

代謝組學分析提供了細胞培養系統中營養利用和代謝瓶頸的詳細理解。例如，基因組規模的代謝模型整合轉錄組學和通量數據來預測營養需求，從而能夠針對性地補充天冬酰胺和谷氨酸等氨基酸，以增強細胞活力和生產力。代謝組學還識別出損害細胞生長的培養基降解產物。例如，核黃素和色氨酸的降解會產生活性氧并消耗關鍵營養物質，導致氧化應激和增殖減少。通過監測這些變化，研究人員可以調整配方以穩定關鍵代謝物并延長培養基效力。

3.4 人工智能驅動的培養基設計

優化細胞培養基仍然是一項關鍵但具有挑戰性的任務，因為成分的高維度及其非線性相互作用。傳統的經驗方法和標準實驗設計（DoE）往往無法捕捉這些復雜的關系，促使轉向數據驅動的算法優化策略。例如，使用帶有梯度提升決策樹的主動學習可以高效地迭代優化廣泛使用的基礎培養基，盡管存在噪聲和有限的數據，但仍能精確定位關鍵成分相互作用。

機器學習已被用于直接優化培養基配方（圖 4）。例如，一種用于按需無血清配方的高維搜索算法，同時將主動學習應用于專門為 HeLa 細胞定制培養基。此外，另一項研究表明，通過主動學習迭代微調多種培養基成分可顯著提高細胞性能。

基于這些見解，人類細胞最佳培養基配方的設計越來越依賴于計算建模和人工智能，以預測和優化營養組合。通過將高通量實驗數據與計算建模無縫集成，支持向量機（SVM）、k 最近鄰（kNN）、隨機森林和神經網絡等一系列機器學習模型在主動學習框架內處理這些數據（圖 4）。通過 AUC、真陽性和假陽性率等性能指標證明的迭代訓練和驗證，能夠提取關鍵特征的差異表達和豐度數據分析。這些輸入隨后由機器學習模型（包括 SVM、kNN、隨機森林和神經網絡）處理。這種方法最大限度地減少了實驗室試錯，從而支持開發可重復和可擴展的培養基配方，以增強細胞性能。

四、未來展望：個性化與可持續的培養基發展

未來細胞培養基優化的發展將通過個性化培養基配方、可持續生產實踐以及 3D 生物打印和器官芯片技術等先進生物技術應用的整合而顯著發展。這項技術已成功應用于各種場景，包括血管化組織和腫瘤微環境的工程，這對研究藥物反應和疾病機制至關重要。此外，器官芯片系統可以利用個性化培養基創建模擬器官功能的動態模型，允許實時監測細胞對治療劑的反應。這些技術的結合不僅提高了體外研究的相關性，還可以加速精準醫學從實驗室到臨床的轉化。生物打印腫瘤模型優化 CAR-T 細胞療法的潛力，凸顯了患者特異性環境在治療成功中的重要性。此外，3D 生物打印模型的開發允許納入各種細胞類型和細胞外基質成分，可以微調以更緊密地模擬體內條件。使用生物相容性材料和環保生產技術可以顯著降低培養基制造的碳足跡。正如 Ali 的工作所強調的，無動物成分的生物打印模型的開發不僅增強了生物相容性，還與生物醫學應用中的可持續發展目標保持一致。

總之，細胞培養基優化的未來在于個性化、可持續性和技術整合的交叉點。盡管個性化培養基配方在精準醫學中前景廣闊，但解決成本、復雜性和監管批準等挑戰對于其廣泛采用至關重要。同時，培養基生產的可持續性和先進生物技術方法的整合將在塑造生物醫學研究和治療發展的未來格局中發揮關鍵作用。

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