隨著分辨率的提升，冷凍電鏡技術(shù)在近些年已經(jīng)成為了解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要手段。

國家納米科學(xué)中心研究員楊雨荷課題組的主要研究方向是通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段，解析抗原抗體相互作用機(jī)制，進(jìn)而理解免疫系統(tǒng)的應(yīng)答規(guī)律，并以此為指導(dǎo)新型疫苗設(shè)計(jì)、抗病毒藥物開發(fā)等課題。

為此，該團(tuán)隊(duì)需要使用冷凍電鏡對各類不同亞型的病毒抗原和抗體復(fù)合物進(jìn)行三維重構(gòu)。

為了重構(gòu)得到高分辨三維模型，研究人員通常需要花費(fèi)數(shù)小時(shí)來采集目標(biāo)樣品照片，從照片中挑選出近百萬個(gè)蛋白質(zhì)顆粒并進(jìn)行平均，才能達(dá)到消除噪聲、提高分辨率的目的。

人們很難分辨單個(gè)顆粒屬于哪種復(fù)合物，尤其是不同病毒亞型的形貌差別很小，因此同一個(gè)電鏡載網(wǎng)上僅能同時(shí)搭載一種確定類型的復(fù)合物。

對于變種極多的病毒抗原，和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的大量不同種類的抗體而言，對它們的復(fù)合物進(jìn)行逐個(gè)數(shù)據(jù)采集需要耗費(fèi)大量的人力和時(shí)間。

基于這一背景，楊雨荷課題組提出了 DNA 納米標(biāo)簽的概念。利用可編程組裝的 DNA 納米結(jié)構(gòu)作為具有特殊形狀的標(biāo)記物，標(biāo)記每種復(fù)合物顆粒的種類信息，使得數(shù)據(jù)處理算法能夠根據(jù) DNA 納米標(biāo)簽的形狀對蛋白顆粒進(jìn)行自動分類，實(shí)現(xiàn)同一個(gè)電鏡載網(wǎng)上搭載多種不同類型的復(fù)合物。

這種多路成像的理念能夠極大地提高電鏡表征的通量，加速病毒抗原和抗體復(fù)合物的篩選和表征。

冷凍電子斷層成像是目前冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展的新興領(lǐng)域。這一技術(shù)通過對一個(gè)特定區(qū)域進(jìn)行不同傾轉(zhuǎn)角度連續(xù)拍照，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)三維模型重構(gòu)的目的。

相比于傳統(tǒng)冷凍電鏡技術(shù)，冷凍斷層成像可以用于對細(xì)胞內(nèi)原位結(jié)構(gòu)的表征，更能反應(yīng)蛋白質(zhì)復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)狀態(tài)。

然而，由于需要對目標(biāo)連續(xù)拍照，每張照片的電子劑量又受到了進(jìn)一步的限制，照片信噪比相比傳統(tǒng)技術(shù)更低。除此之外，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境充滿了各類復(fù)雜的蛋白質(zhì)，這進(jìn)一步使得目標(biāo)顆粒的識別和定位變得更加困難。

面對這一挑戰(zhàn)，楊雨荷團(tuán)隊(duì)認(rèn)為襯度強(qiáng)、尺寸大、形狀特異性高的 DNA 納米標(biāo)簽有望在細(xì)胞原位精確指示目標(biāo)顆粒位置，成為分析細(xì)胞原位環(huán)境中蛋白顆粒的重要工具。

日前，相關(guān)論文以《用于多路單粒子電子顯微鏡和原位電子冷凍斷層掃描的 DNA 納米標(biāo)簽》（DNA Nanotags for Multiplexed Single-Particle Electron Microscopy and In Situ Electron Cryotomography）為題發(fā)在JACS Au[1]，該團(tuán)隊(duì)博士生陳遠(yuǎn)方、黃一倩是第一作者，楊雨荷擔(dān)任通訊作者。

圖 | 相關(guān)論文（來源：JACS Au）

總的來說，本次工作探索了 DNA 納米標(biāo)簽在輔助電鏡成像上的可能性。相關(guān)論文討論了 DNA 納米結(jié)構(gòu)作為納米標(biāo)簽的三項(xiàng)優(yōu)勢。

其一，DNA 納米結(jié)構(gòu)是一種高度可編程的結(jié)構(gòu)，利用現(xiàn)有的技術(shù)可以在納米尺度精確設(shè)計(jì)出任意形狀的納米結(jié)構(gòu)。

其二，目前已經(jīng)有大量論文證明，DNA 納米結(jié)構(gòu)可以很簡單地修飾不同的蛋白質(zhì)及其他功能分子。

其三，DNA 納米結(jié)構(gòu)也被證明具有一定的穩(wěn)定性，至少在冷凍制樣的時(shí)間尺度內(nèi)可以保持自身結(jié)構(gòu)的完整性。

在多路電鏡成像中，本次論文認(rèn)為 DNA 納米標(biāo)簽可能會對蛋白顆粒的信號造成干擾。為此，本次論文討論了去除這種信號干擾的可能方法，包括在設(shè)計(jì)上拉遠(yuǎn) DNA 和蛋白之間的聚集，以及使用算法削弱 DNA 結(jié)構(gòu)的信號等。

在原位成像方面，DNA 納米結(jié)構(gòu)如何進(jìn)入細(xì)胞，并在細(xì)胞中遷移并最終到達(dá)目標(biāo)位點(diǎn)是一項(xiàng)重大的挑戰(zhàn)。因此，本次論文著重論述了目前可能的實(shí)現(xiàn)方法，包括利用細(xì)胞跨膜運(yùn)輸通道、直接跨膜遞送、原位表達(dá) RNA 納米結(jié)構(gòu)等可能的實(shí)現(xiàn)手段。

DNA 納米標(biāo)簽在活細(xì)胞中的原位蛋白質(zhì)的標(biāo)記的實(shí)現(xiàn)，目前急需解決的是高效遞送和胞內(nèi)遷移的問題。楊雨荷表示：“在推進(jìn)這一概念實(shí)現(xiàn)的過程中，我認(rèn)為我們應(yīng)該采用“先通后優(yōu)”的策略。先通過對現(xiàn)有的技術(shù)和成果的整合，在初期階段保證基本功能的實(shí)現(xiàn)。在驗(yàn)證核心功能和路徑有效后，再進(jìn)行優(yōu)化效率、提高普適性的探索”

她繼續(xù)說道：“因?yàn)楸M管我們已經(jīng)做了盡量全面的設(shè)想和分析，有合理的論據(jù)作為支撐，但實(shí)踐的過程中往往還會遇到新的問題。目前來說，針對 DNA 納米標(biāo)簽原位標(biāo)記蛋白質(zhì)用于結(jié)構(gòu)解析這一目的，我們已經(jīng)在開展試驗(yàn)進(jìn)行探索?！?/p>

基于細(xì)胞冷凍斷層成像技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化流程，通過聚焦離子束技術(shù)，他們從細(xì)胞中減薄得到一個(gè) 100nm-200nm 厚的“小薄片”，但是不能精準(zhǔn)定位到細(xì)胞中感興趣的區(qū)域，這也使得下一步在減薄得到的“小薄片”中定位納米尺度的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)提高了難度。

基于此，課題組認(rèn)為首先應(yīng)選擇在細(xì)胞中豐度較高的蛋白質(zhì)作為目標(biāo)模版，進(jìn)行 DNA 納米標(biāo)簽方法的探索。

另一方面，細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)構(gòu)在電子顯微鏡下具有較好的襯度，具有“電鏡低倍下可分辨性”。

綜上，如果以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上豐度較高的蛋白質(zhì)作為 DNA 納米標(biāo)簽的標(biāo)記目標(biāo)，可以通過 DNA 納米結(jié)構(gòu)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的“共定位”判斷 DNA 納米標(biāo)簽的功能性，同時(shí)證明胞內(nèi)遷移這一問題是可以克服的。

由此，再進(jìn)一步聚焦于探究 DNA 納米標(biāo)簽挑選蛋白質(zhì)的重構(gòu)策略，最終實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)原位蛋白結(jié)構(gòu)的解析。

在 DNA 標(biāo)簽的功能已經(jīng)得到驗(yàn)證之后，最后還需要從成本、簡便性和普適性的角度進(jìn)一步優(yōu)化，為制備細(xì)胞原位蛋白結(jié)構(gòu)解析顆粒挑選的“通用型”試劑盒提供基礎(chǔ)。

歸根結(jié)底，DNA 納米標(biāo)簽技術(shù)是探索細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)在原位狀態(tài)下結(jié)構(gòu)的工具。課題組探索的最終目的是通過 DNA 納米標(biāo)簽的輔助，利用冷凍斷層成像技術(shù)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，進(jìn)一步認(rèn)識和理解蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的機(jī)制，研究其構(gòu)效關(guān)系，為人類改造自然和人工制造提供思路指導(dǎo)和借鑒。

總之，其所使用的工具是時(shí)有更迭的，是基于現(xiàn)有的成果和技術(shù)開發(fā)的一種探究手段，但對生命體機(jī)制的探索是永恒的話題。

下一步，他們計(jì)劃先設(shè)計(jì)不同形狀的 DNA 納米結(jié)構(gòu)，分別標(biāo)記同一種病毒的不同抗原亞型，與抗體結(jié)合后使用電鏡觀察。驗(yàn)證這種策略能否有效識別蛋白顆粒種類，并希望能夠重構(gòu)得到正確的抗原抗體結(jié)合信息。

參考資料：

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.4c00986

運(yùn)營/排版：何晨龍