摘要：除了效力之外，良好的成藥性是生物藥物的一個(gè)關(guān)鍵屬性。在藥物開發(fā)過程的早期選擇和篩選這些屬性可以節(jié)省資源并避免代價(jià)高昂的后期失敗。在這里，我們回顧了一些最重要的可開發(fā)性特性，這些特性可以在生物制劑的早期評估。這些因素包括生物制劑來源的影響、其生物物理和藥代動(dòng)力學(xué)特性以及其重組表達(dá)的程度。我們還在計(jì)算機(jī)、體外和體內(nèi)提出了可在發(fā)現(xiàn)過程的不同階段利用的方法和技術(shù)，以識(shí)別具有缺陷的分子，從而促進(jìn)選擇最佳藥物先導(dǎo)物。最后，我們反思了注射劑與口服生物制劑最相關(guān)的成藥性參數(shù)，并展望了生物制劑開發(fā)中預(yù)計(jì)會(huì)出現(xiàn)的總體趨勢。

【NO.1】介紹

將生物制劑從早期發(fā)現(xiàn)推向市場是一項(xiàng)非常昂貴的工作，臨床開發(fā)中的高流失率進(jìn)一步加劇了平均投資。雖然生物制劑的臨床成功最終取決于其在人類患者中的安全性和有效性，但這些終點(diǎn)的潛在特性包括從藥物效力、特異性、免疫原性和藥代動(dòng)力學(xué)到體內(nèi)和儲(chǔ)存過程中的生物物理行為等方方面面。此外，隨著雙特異性抗體和抗體-藥物偶聯(lián)物等更先進(jìn)的生物制劑的開發(fā)，當(dāng)生物制劑必須以始終如一的高質(zhì)量重復(fù)生產(chǎn)時(shí)，化學(xué)、制造和控制（CMC）以及監(jiān)管方面可能是商業(yè)成功的關(guān)鍵。這些性能指標(biāo)結(jié)合起來，通常被稱為生物制劑的“可開發(fā)性”。這篇綜述將介紹生物制劑的不同可開發(fā)性參數(shù)，并討論如何使用計(jì)算機(jī)、體外和體內(nèi)方法評估和優(yōu)化這些參數(shù)（圖1）。如果得到最佳利用，對成藥性特性的評估和改進(jìn)可以降低損耗率，并提高可制造性，從而能夠生產(chǎn)出更高質(zhì)量、更低成本的生物制劑，造福全球患者。

圖1.抗體來源、發(fā)現(xiàn)策略、體外測定和計(jì)算機(jī)模擬方法的示意圖概述，用于評估生物制劑開發(fā)過程中的可開發(fā)性特性

【NO.2】抗體來源

抗體和抗體片段構(gòu)成了最大的生物制劑組?？贵w通常來自血漿、雜交瘤/或重組細(xì)胞系，并源自自然（動(dòng)物或人類）或合成序列。來源和來源都可能影響抗體的可開發(fā)性。天然抗體來源于天然、非工程序列，通常來源于（免疫）動(dòng)物或患者群體，是迄今為止最常用的抗體來源。這種抗體本身具有來源于生物的優(yōu)勢，并且在體內(nèi)經(jīng)歷了親和成熟和自我耐受性，這通常會(huì)導(dǎo)致良好的可開發(fā)性。然而，在臨床使用方面，人類和動(dòng)物源性抗體之間存在明顯差異。雖然前者構(gòu)成的抗體具有較低的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，但非人類來源的抗體可能會(huì)在患者中引起嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，具體取決于它們的來源動(dòng)物。

為了避免這些限制，其他類型的抗體越來越受歡迎，即合成抗體。此類抗體可能來源于合理設(shè)計(jì)的重組抗體庫，通常通過體外展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)。使用此類方法可以對抗體庫進(jìn)行大量控制。然而，合成抗體通常具有未經(jīng)過體內(nèi)成熟且來源于天然來源的缺點(diǎn)。因此，它們可能帶來意想不到的可開發(fā)性問題，例如不需要的多反應(yīng)性、免疫原性、聚集傾向和表達(dá)譜不佳。盡管如此，結(jié)合復(fù)雜的顯示技術(shù)和先進(jìn)的計(jì)算工具，可以將這些風(fēng)險(xiǎn)降至最低。

【NO.3】顯示技術(shù)的進(jìn)步

在過去的幾十年里，顯示技術(shù)允許創(chuàng)建大量多樣的抗體和其他蛋白質(zhì)和肽群，從中可以分離出具有所需靶標(biāo)結(jié)合特性的單個(gè)變體。然而，生成抗體藥物的要求并不僅僅圍繞抗體的結(jié)合特異性或親和力。其他因素會(huì)影響先導(dǎo)候選抗體開發(fā)成有效、可制造、安全和穩(wěn)定藥物的可能性。例如，抗體在較高濃度配方時(shí)聚集的傾向、非特異性相互作用發(fā)生的程度以及抗體的藥代動(dòng)力學(xué)都可能導(dǎo)致先導(dǎo)分子在開發(fā)過程中失敗。

在應(yīng)用展示技術(shù)時(shí)，抗體群可能來自人類和非人類供體B細(xì)胞的重排抗體基因，由合成抗體基因構(gòu)建，這些基因在寡核苷酸合成過程中引入了變異或兩者的組合。無論起始來源如何，都可能出現(xiàn)可開發(fā)性問題，即使是“天然”免疫衍生抗體也可能受到生物物理責(zé)任的影響。研究還表明，僅專注于提高親和力的先導(dǎo)抗體工程改造可以產(chǎn)生生物物理特性較差的親和力增強(qiáng)變體。基于這些方法，可以產(chǎn)生和評估單個(gè)變體以改善生物物理特性。在某些情況下，克隆的可開發(fā)性問題可以通過識(shí)別有問題的區(qū)域（例如，疏水斑塊）、產(chǎn)生單個(gè)變體并評估這些變體以改善生物物理特性來解決。

從歷史上看，在初步發(fā)現(xiàn)、親和力優(yōu)化和選擇用于臨床前開發(fā)的抗體藥物先導(dǎo)物后，已經(jīng)解決了對可開發(fā)性的考慮。越來越多的藥物開發(fā)人員在發(fā)現(xiàn)過程的早期評估生物物理特性，認(rèn)識(shí)到這將避免以后的時(shí)間和金錢損失。與其等待篩選數(shù)十到數(shù)百個(gè)輸出克隆的生物物理特性，不如創(chuàng)建大型變體顯示庫并直接選擇良好的生物物理特征，這將極大地促進(jìn)尋找具有最佳特性的抗體變體。

選擇技術(shù)的力量，最好的例子是在噬菌體上顯示（噬菌體展示），已應(yīng)用于選擇克隆以獲得更高的熱穩(wěn)定性通過將克隆文庫暴露在高溫下并選擇與蛋白A或蛋白L的保留結(jié)合，這需要正確的折疊。其他人將抗體文庫置于酸性條件下，以再次鑒定結(jié)合熱力學(xué)穩(wěn)定性和抗聚集性去折疊狀態(tài)的克隆。

雖然選擇熱穩(wěn)定性低的克隆有助于確定聚集傾向，但可能存在熔解溫度正常的克隆，其中生物物理問題僅在抗體濃縮時(shí)出現(xiàn)。因此，需要其他選擇方法。噬菌體展示能力（將編碼基因與其展示的產(chǎn)品偶聯(lián)）的原理也已應(yīng)用于使用桿狀病毒的其他展示系統(tǒng)，核糖體酵母和高等真核生物，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。特別是哺乳動(dòng)物展示，似乎比其他系統(tǒng)具有優(yōu)勢。使用哺乳動(dòng)物顯示系統(tǒng)表明，具有不同生物物理特性的密切相關(guān)的克隆可以簡單地根據(jù)顯示水平來區(qū)分。因此，抗體暴露于高濃度下，生物物理特性較差的克隆可能會(huì)在如此高的表面濃度下聚集，聚集體可能被細(xì)胞的質(zhì)量控制機(jī)制去除。反過來，這會(huì)導(dǎo)致這種易聚集或“粘性”克隆的呈遞水平較低。

這種通過哺乳動(dòng)物展示檢測生物物理特性的能力允許從變體庫中選擇具有改進(jìn)可開發(fā)性特征的克隆。在實(shí)踐中，創(chuàng)建了文庫，并選擇了具有最高表達(dá)水平的克隆。多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)允許在保留抗原結(jié)合的同時(shí)篩選最佳生物物理特性，從而允許在保留靶標(biāo)結(jié)合的同時(shí)處理參與靶標(biāo)結(jié)合的旁位殘基以改善生物物理特性。因此，這些實(shí)驗(yàn)和其他實(shí)驗(yàn)展示了如何微調(diào)體外展示技術(shù)，以從一開始就發(fā)現(xiàn)具有改進(jìn)成影性特征的抗體。

【NO.4】生物物理表征

無論使用哪種策略進(jìn)行抗體發(fā)現(xiàn)，通常都有幾種早期候選藥物，從幾十種到數(shù)千種不等，必須將其減少到一種用于細(xì)胞系開發(fā)和生產(chǎn)的候選藥物。為了選擇最佳候選抗體，除了功能特性外，人們還越來越關(guān)注治療性抗體的生物物理特性，這使得在藥物開發(fā)過程的早期就能夠取消選擇開發(fā)性差的抗體。有多種可開發(fā)性檢測方法可促進(jìn)這種選擇，據(jù)報(bào)道，這些檢測方法與臨床階段抗體的損耗率在不同程度上相關(guān)。

抗體藥物的一個(gè)關(guān)鍵特征是其高特異性，定義為高靶向結(jié)合和低脫靶和非特異性結(jié)合，這對于降低異常藥代動(dòng)力學(xué)和快速抗體清除的風(fēng)險(xiǎn)非常重要。為了評估非特異性結(jié)合，最常用的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）通常涉及與多個(gè)非靶標(biāo)的結(jié)合。為了提高靈敏度，多特異性顆粒（PSP）測定等檢測，這涉及通過流式細(xì)胞術(shù)檢測復(fù)雜抗原混合物或確定的蛋白質(zhì)試劑與蛋白A包被珠上固定抗體的結(jié)合。與PSP檢測類似，其他檢測也使用復(fù)雜的抗原混合物，包括桿狀病毒顆粒、全細(xì)胞，和細(xì)胞裂解物（多特異性試劑，PSR）。PSR已被證明與交叉相互作用色譜（CIC）密切相關(guān)。因此，研究非特異性相互作用的另一種方法是色譜法。在CIC中，非特異性蛋白質(zhì)相互作用，通過其相對保留時(shí)間進(jìn)行檢測。相反，一種相關(guān)的層析方法，即立式單層層析（SMAC），可檢測單克隆抗體與色譜柱之間的非特異性相互作用。除了特異性外，SMAC測量還可識(shí)別沉淀和聚集可能性增加的抗體。非特異性結(jié)合也可由表面疏水性誘導(dǎo)，通常使用疏水作用色譜（HIC）進(jìn)行定量。

抗體藥物的另一個(gè)關(guān)鍵特征是它們的高膠體穩(wěn)定性和低自締合和聚集傾向，這對于用于皮下給藥的濃縮液體制劑尤其重要。已經(jīng)報(bào)道了幾種用于評估抗體自締合的測定方法，包括靜態(tài)和動(dòng)態(tài)光散射。雖然這些檢測已被證明是有價(jià)值的，但由于它們需要高抗體濃度和純度，因此與早期開發(fā)不兼容。因此，已經(jīng)開發(fā)了替代分析方法，包括自相互作用色譜（SIC）、中投公司以及通過生物膜干涉測量法進(jìn)行克隆自相互作用，后者已被證明與SIC和CIC相關(guān)。為了實(shí)現(xiàn)更高的通量和使用低抗體濃度，已經(jīng)報(bào)道了兩種基于納米顆粒的分析，即親和捕獲自相互作用納米顆粒光譜（AC-SINS）和電荷穩(wěn)定自相互作用納米粒子光譜（CS-SINS）。AC-SINS最常在模擬生理?xiàng)l件（pH7.4，磷酸鹽緩沖鹽水）。其測量值通常與藥代動(dòng)力學(xué)特性有關(guān)，盡管它也已用于配方應(yīng)用。CS-SINS在常見的制劑條件（pH值6,10mM組氨酸）下進(jìn)行，據(jù)報(bào)道，它可以識(shí)別濃縮抗體制劑中低粘度和乳白色的抗體。

治療性抗體的第三個(gè)關(guān)鍵特征是其高折疊穩(wěn)定性。鑒于配制的抗體具有數(shù)年的保質(zhì)期，因此獲得實(shí)時(shí)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)非常耗時(shí)。為了加速穩(wěn)定性分析，通常使用各種應(yīng)力條件。熱穩(wěn)定性通常使用差示掃描量熱法或差示掃描熒光法進(jìn)行測量。除了溫度之外，表面介導(dǎo)的應(yīng)力還可用于評估抗體穩(wěn)定性。例如，最近描述的疏水性納米顆粒表面應(yīng)力測定法與跨越一系列溶解度值的14種抗體變體一起使用，以鑒定在空氣-水界面存在下對攪動(dòng)高度不穩(wěn)定性的變體。此外，通過這種表面介導(dǎo)的應(yīng)力分析進(jìn)行的聚集評估與評估生物物理特性的其他方法（例如溫度誘導(dǎo)聚集和AC-SINS）密切相關(guān)。綜上所述，這些和其他體外檢測使藥物開發(fā)人員能夠選擇具有更優(yōu)的可開發(fā)性特征組合的抗體。然而，所有體外檢測都需要抗體的表達(dá)，有時(shí)包括純化和配制，然后在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了能夠篩選更多數(shù)量的抗體，降低成本、體力勞動(dòng)和對抗體蛋白的需求，計(jì)算機(jī)方法現(xiàn)在越來越受到關(guān)注，并且存在多種解決可開發(fā)性問題的計(jì)算策略，并且正在迅速開發(fā)其他策略。

【NO.5】大數(shù)據(jù)、機(jī)器學(xué)習(xí)和可開發(fā)性計(jì)算評估

計(jì)算評估在評估生物制劑的可開發(fā)性方面發(fā)揮著重要作用，在生物治療藥物發(fā)現(xiàn)的早期階段特別有用，因?yàn)橥ǔ缀鯖]有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用。例如，應(yīng)用計(jì)算評估的理想階段是在對從免疫或展示實(shí)驗(yàn)中獲得的抗體結(jié)合物的片段可變區(qū)（Fvs）進(jìn)行測序后立即進(jìn)行測序，此時(shí)需要選擇結(jié)合劑的子集進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)（圖2)。這種選擇的典型策略包括根據(jù)VH-VL種系對的多樣性和表位/旁位多樣性進(jìn)行抗體聚集。鑒于免疫接種活動(dòng)通常會(huì)產(chǎn)生數(shù)千個(gè)潛在的命中序列，因此在此階段納入可開發(fā)性評估對于確保集中使用可用的實(shí)驗(yàn)資源非常重要。大部分編碼的抗體可能在隨后的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)中未結(jié)合，或表現(xiàn)出多種可開發(fā)性挑戰(zhàn)。通過計(jì)算分析標(biāo)記此類抗體有助于確定抗體的實(shí)驗(yàn)檢測優(yōu)先級(jí)（圖2)。此階段的可開發(fā)性評估可以包括基于序列和結(jié)構(gòu)的方法或它們的組合。

圖2.用于表征抗體生物物理特性的知識(shí)和基于物理的方法

成影性評估的典型組成部分應(yīng)包括檢測化學(xué)降解基序，例如氧化、脫酰胺、Asp異構(gòu)化，以及糖基化基序和非經(jīng)典Cys殘基的存在。人性百分比（或“自然性”），也可以使用基于序列的方法預(yù)測潛在的聚集易發(fā)區(qū)域和MHCII類結(jié)合免疫表位。近年來抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測的進(jìn)步使定期對抗體可變區(qū)進(jìn)行快速可靠的高通量建模成為可能。盡管如此，最近對理解CDR-H3構(gòu)象行為及其預(yù)測的貢獻(xiàn)表明，仍然存在對更好模型的需求。現(xiàn)在，使用適度的計(jì)算資源對數(shù)百甚至數(shù)千個(gè)抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模是可行的。這些Fv模型可用于計(jì)算多種物理化學(xué)描述符，例如等電點(diǎn)（pI）、電荷、疏水不平衡、埋在VH-VL界面上的表面積以及分子表面斑塊。這些描述符描述了抗體的靜電和疏水特性及其構(gòu)象穩(wěn)定性。

抗體的pI是一項(xiàng)重要特性，可能會(huì)以多種方式影響可開發(fā)性。它會(huì)影響各個(gè)方面，包括與抗體純化、配方（例如穩(wěn)定性和粘度）和藥代動(dòng)力學(xué)特性相關(guān)的方面。通常，治療性抗體的等電點(diǎn)在6到9之間。然而，對于一些等電點(diǎn)相對較低（pI<6.5-7）或較高（pI>8.5-9）的抗體，已經(jīng)報(bào)道了各種顯影性挑戰(zhàn)。此外，抗體pI會(huì)影響藥代動(dòng)力學(xué)、組織分布、并與FcRn結(jié)合，從而獲得抗體半衰期。通過將新發(fā)現(xiàn)的已確認(rèn)結(jié)合物（苗頭化合物）的計(jì)算特性與臨床上或目前市場上可用的抗體的結(jié)合物（命中）進(jìn)行比較，人們可以分析這些HIT的藥物相似性。

在選擇用于實(shí)驗(yàn)測試的抗體中，計(jì)算成藥性評估可以幫助識(shí)別具有功能和物理化學(xué)屬性最佳組合的潛在先導(dǎo)分子。然而，根據(jù)單個(gè)藥物發(fā)現(xiàn)項(xiàng)目的特點(diǎn)，這些先導(dǎo)分子可能需要親和成熟，人性化以新型分子結(jié)構(gòu)格式化，并通過開發(fā)平臺(tái)進(jìn)一步優(yōu)化健身。這需要使用計(jì)算蛋白質(zhì)工程工具來優(yōu)化先導(dǎo)分子。如果先導(dǎo)分子的最終分子形式是單克隆IgG抗體，那么為提高可開發(fā)性屬性而對可變區(qū)進(jìn)行計(jì)算工程更有可能轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)可驗(yàn)證的結(jié)果，并且令人驚訝的是，只有少數(shù)突變可以顯著改善候選藥物的CMC特性。

一旦選擇了一個(gè)或幾個(gè)最佳先導(dǎo)分子，發(fā)現(xiàn)項(xiàng)目就會(huì)進(jìn)入早期開發(fā)階段。在此階段，將評估優(yōu)化的主要候選藥物是否適合開發(fā)平臺(tái)。計(jì)算成影性評估現(xiàn)在應(yīng)涉及對全長抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模，以更準(zhǔn)確地描述計(jì)算的特性及其與涉及大量材料和更大樣品量的標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)實(shí)驗(yàn)的一致性。在這些階段使用多尺度分子模擬和機(jī)器學(xué)習(xí)模型有助于識(shí)別早期配方過程挑戰(zhàn)，例如聚集、擴(kuò)散相互作用、粘度和溶解度。理化降解/和免疫原性。具體來說，使用顯式溶劑分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬有可能提供分子對熱和其他應(yīng)力響應(yīng)的分子水平理解。擴(kuò)大此類模擬的范圍以包括配方緩沖液、鹽、pH值和賦形劑的考慮，將為生物制劑的計(jì)算機(jī)模擬配方開發(fā)鋪平道路。最后，雖然大多數(shù)序列和可開發(fā)性報(bào)告都基于生物物理模型，但正在開發(fā)用于預(yù)測可開發(fā)性參數(shù)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法，這些方法無需結(jié)構(gòu)建模即可從抗體序列中推斷出可開發(fā)性參數(shù)。

雖然上述機(jī)器學(xué)習(xí)方法是區(qū)分任務(wù)（例如，預(yù)測變量X），但深度學(xué)習(xí)也允許“生成機(jī)器學(xué)習(xí)”的可能性，其中包括學(xué)習(xí)具有特定特性的抗體序列訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的底層特征，然后生成新的抗體序列，與訓(xùn)練數(shù)據(jù)集不同，但具有與訓(xùn)練數(shù)據(jù)集相似的屬性（也稱為特征），其中，特征可以由可開發(fā)性參數(shù)組成，綁定參數(shù)，或兩者兼而有之。有趣的是，使用模擬框架，最近表明生成式學(xué)習(xí)可以探索新的綁定和可開發(fā)性空間。然而，在多大程度上，分布外（生成具有訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中未包含的特征的抗體序列）學(xué)習(xí)是可行的，以及完成這項(xiàng)任務(wù)需要多少訓(xùn)練數(shù)據(jù)，仍有待確定。此外，到目前為止，還沒有以抗體為中心的生成方法可以生成具有多個(gè)預(yù)先指定特征的抗體。大規(guī)模模擬可能有助于了解此類任務(wù)所需的最低數(shù)據(jù)復(fù)雜性。總之，計(jì)算在評估生物制劑的可開發(fā)性方面起著重要作用。

【NO.6】來自結(jié)構(gòu)和分子動(dòng)力學(xué)的生物制劑的生物物理特性

抗體的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)表征是化學(xué)修飾、抗原識(shí)別和受體結(jié)合等工程特性的先決條件。蛋白質(zhì)，尤其是抗體的三維結(jié)構(gòu)不是靜態(tài)的，而是不斷波動(dòng)的。這些波動(dòng)可能發(fā)生在不同的時(shí)間尺度上，范圍從低納秒到秒不等。即使是罕見的構(gòu)象，如果它們導(dǎo)致不可逆的修飾或單側(cè)平衡的一部分，例如聚集或化學(xué)修飾（圖2A）。此外，一些研究使用分子動(dòng)力學(xué)模擬來估計(jì)抗體的熱穩(wěn)定性。例如，從高溫模擬中計(jì)算的天然接觸分?jǐn)?shù)已被證明與實(shí)驗(yàn)熔化溫度相關(guān)。

為了闡明抗體的功能和特性，單靜態(tài)結(jié)構(gòu)并不總是足夠的，因此，抗體旁位可以被表征為溶液中的構(gòu)象集合。這些旁位集合已經(jīng)通過相關(guān)的CDR環(huán)運(yùn)動(dòng)以及域間和肘角重排來描述?？乖Y(jié)合位點(diǎn)的這種高度靈活性和構(gòu)象多樣性，特別是CDR-H3環(huán)，對抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測提出了挑戰(zhàn)。盡管抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測取得了重大進(jìn)展，在進(jìn)一步處理之前仔細(xì)評估結(jié)構(gòu)模型至關(guān)重要，因?yàn)槟承┠Ｐ涂赡馨Y(jié)構(gòu)不準(zhǔn)確，從而大大惡化了生物物理表面特性預(yù)測。在根據(jù)載脂蛋白X射線結(jié)構(gòu)預(yù)測抗體結(jié)構(gòu)時(shí)必須特別小心，因?yàn)榫w堆積效應(yīng)可能會(huì)扭曲抗體結(jié)構(gòu)，因此與主要的溶液結(jié)構(gòu)不符。

通過將抗體視為溶液中的集合來考慮抗體的高構(gòu)象多樣性，不僅可以促進(jìn)結(jié)構(gòu)預(yù)測，還可以指導(dǎo)工程工作流程，促進(jìn)確定可開發(fā)性缺陷并優(yōu)化生物物理特性。例如，已經(jīng)表明，低種群狀態(tài)（圖2A-B），在疏水表面附近和相邊界處變得更加頻繁。與表面的疏水相互作用導(dǎo)致構(gòu)象向更疏水的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，這反過來又更容易聚集（圖2A-B).同樣，高溫使集合體轉(zhuǎn)向易聚集的構(gòu)象。這種效應(yīng)在實(shí)驗(yàn)上被視為不可逆的聚集。因此，有必要將抗體特性描述為結(jié)構(gòu)的集合。分子動(dòng)力學(xué)模擬在解決方案中提供這樣的集成，從而增加包含負(fù)責(zé)疏水或聚集行為的構(gòu)象的可能性（圖2C-D).一些工作研究了構(gòu)象集合對疏水性的影響。雖然基于疏水性標(biāo)度的更粗略的方法通常對結(jié)構(gòu)差異不太敏感，一項(xiàng)基于顯式溶劑熱力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，輸入結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈方向?qū)λ嘘P(guān)鍵影響。

已經(jīng)表明，結(jié)合和生物物理特性的抗體可以是電荷依賴性的。然而，蛋白質(zhì)中氨基酸的pKa仍然非常難以預(yù)測。與蛋白質(zhì)pKa計(jì)算等經(jīng)驗(yàn)方法相比，為單個(gè)結(jié)構(gòu)分配質(zhì)子化態(tài)，恒定的pH分子動(dòng)力學(xué)允許在結(jié)構(gòu)采樣中加入質(zhì)子化變化。捕獲質(zhì)子化的變化對于設(shè)計(jì)pH反應(yīng)性抗體尤為重要，例如靶向酸化腫瘤微環(huán)境。

因此，我們強(qiáng)烈建議將抗體視為溶液中的構(gòu)象集合，這可以改進(jìn)結(jié)構(gòu)預(yù)測并允許評估促進(jìn)抗體治療藥物開發(fā)的生物物理特性。

【NO.7】用于成影性評估的細(xì)胞檢測

對于患者的免疫系統(tǒng)來說，治療性生物制劑是外來分子，因此它們可能具有免疫原性。由結(jié)構(gòu)性狀和配方引起的免疫原性會(huì)引發(fā)急性和長期問題。ADA和生物制劑之間形成的復(fù)合物會(huì)對患者產(chǎn)生不利影響，這可能與先天免疫反應(yīng)有關(guān)，導(dǎo)致抗原呈遞、炎性細(xì)胞因子分泌以及T細(xì)胞和B細(xì)胞激活。根據(jù)所涉及的免疫細(xì)胞的類型，免疫激活可能會(huì)導(dǎo)致也可能不會(huì)導(dǎo)致ADA。抗體免疫原性的驅(qū)動(dòng)因素是T細(xì)胞活化和隨后的細(xì)胞因子釋放。這可以通過使用免疫細(xì)胞活化試驗(yàn)在體外解決，其中混合的外周血單核細(xì)胞暴露于候選生物制劑中，以揭示激活T細(xì)胞表位的存在。這種分析的一般原理如圖3.這種類型的測定已被證明與單克隆IgG抗體的臨床免疫原性相關(guān)，因?yàn)樗沂玖薚細(xì)胞增殖的增加和促炎細(xì)胞因子（如IL-2和IFN-γ）的釋放。并被歐洲藥品管理局和美國食品藥品管理局強(qiáng)調(diào)為重要工具。雖然此類工具通常用于降低臨床前開發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，但生物制劑的住院免疫原性仍然難以預(yù)測，這可能是由于藥物遞送的變化、使用給定生物制劑的治療環(huán)境以及人類免疫庫的復(fù)雜性，包括人類白細(xì)胞抗原的個(gè)體單倍型。

圖3.外周血單核細(xì)胞（PBMC）免疫原性測定的示意圖

IgG抗體和基于白蛋白的生物制劑在屏障內(nèi)和屏障之間具有良好的運(yùn)輸特性，使它們在人類中的血漿半衰期平均為三周。這是由于它們能夠與新生兒Fc受體（FcRn）結(jié)合，而新生兒Fc受體（FcRn）主要存在于多種非造血細(xì)胞和造血細(xì)胞類型的酸化內(nèi)體中。在這里，F(xiàn)cRn通過液相胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞后遇到配體，并以pH依賴性方式與配體結(jié)合，其中結(jié)合發(fā)生在弱酸性pH值下，在中性pH值下不會(huì)發(fā)生結(jié)合或釋放。這指導(dǎo)細(xì)胞循環(huán)或轉(zhuǎn)胞吞作用，因此，F(xiàn)cRn結(jié)合使配體免于細(xì)胞內(nèi)降解，從而導(dǎo)致高血液濃度和較長的血漿半衰期。不同生物制劑經(jīng)歷這一過程的效率對其藥代動(dòng)力學(xué)特性和生物分布有巨大影響。這促進(jìn)了生物物理方法的建立，例如，通過使用表面等離子體共振、微量熱泳和親和色譜技術(shù)來確定pH依賴性與FcRn的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，目的是預(yù)測FcRn介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。雖然這些可訪問的高通量生物物理方法可以提供有關(guān)在給定pH條件下結(jié)合的信息，但它們通常不會(huì)揭示分子在整個(gè)pH梯度中如何結(jié)合FcRn，因此不會(huì)直接模擬細(xì)胞設(shè)置。然而，pH梯度可以通過分析型FcRn親和色譜法來模擬，其中pH值逐漸升高以解決FcRn靶向分子從偶聯(lián)到基質(zhì)的受體上的解離問題。雖然此類研究可以揭示有價(jià)值的信息，但應(yīng)謹(jǐn)慎使用，因?yàn)樗鼈儧]有考慮到FcRn嵌入帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜中并遵循涉及不同內(nèi)體結(jié)構(gòu)的運(yùn)輸途徑這一事實(shí)。

此外，它們沒有解釋不同細(xì)胞類型使用FcRn進(jìn)行配體轉(zhuǎn)運(yùn)和抗原呈遞以及與Fcγ受體協(xié)同加工免疫復(fù)合物的多樣性。此外，在細(xì)胞環(huán)境中，F(xiàn)cRn與IgG和白蛋白復(fù)合物的化學(xué)計(jì)量很復(fù)雜，遠(yuǎn)未完全了解。因此，仍然需要可靠的檢測方法，可用于以FcRn非依賴性和依賴性方式剖析IgG和基于白蛋白的形式細(xì)胞處理的決定因素。這種類型的見解可以通過識(shí)別所謂的“危險(xiǎn)信號(hào)”來指導(dǎo)先導(dǎo)化合物的選擇，例如，在發(fā)現(xiàn)過程的早期，包括多反應(yīng)性、穩(wěn)定性和不利的藥代動(dòng)力學(xué)。這些特性源于生物物理特性，如表面電荷、電荷貼片、等電點(diǎn)和疏水性，并影響FcRn結(jié)合、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和體內(nèi)性能。因此，模擬這些性狀的細(xì)胞檢測至關(guān)重要，并且可以為計(jì)算分析提供必要的數(shù)據(jù)輸入。

事實(shí)上，存在針對FcRn介導(dǎo)的細(xì)胞再循環(huán)和轉(zhuǎn)胞吞作用的細(xì)胞檢測，并已被用于揭示如何攝取和分類FcRn結(jié)合形式。這些測定進(jìn)一步用于預(yù)測體內(nèi)特性，例如細(xì)胞運(yùn)輸特性與血漿半衰期或清除率之間的相關(guān)性。這些檢測可以包括先進(jìn)的活細(xì)胞成像，以追蹤受體及其配體，并產(chǎn)生有價(jià)值的機(jī)制見解。然而，雖然有用且產(chǎn)生高分辨率，但成像依賴于蛋白質(zhì)標(biāo)記，這可能會(huì)影響整體穩(wěn)定性以及FcRn結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)。雖然許多報(bào)告?zhèn)戎赜跍y量從細(xì)胞中或跨細(xì)胞運(yùn)輸?shù)姆肿訑?shù)量，但也應(yīng)考慮細(xì)胞內(nèi)積累和降解的速率。考慮這些參數(shù)的重要性通過使用基于人內(nèi)皮細(xì)胞的回收測定（HERA）來證明，其中細(xì)胞過表達(dá)人FcRn。HERA可用于篩選FcRn靶向分子的攝取能力，然后將它們從細(xì)胞內(nèi)積累和/或降解中拯救出來（圖4A)。

值得注意的是，HERA只需要少量蛋白質(zhì)，無需標(biāo)記，因?yàn)榭梢酝ㄟ^ELISA設(shè)置對收集的樣品進(jìn)行參數(shù)測量。此外，該測定允許縱pH值和阻斷配體結(jié)合位點(diǎn)，以及調(diào)節(jié)受體表達(dá)水平，這樣就可以根據(jù)特定需求和問題（圖4B).這提供了廣泛的實(shí)用性，并且細(xì)胞讀數(shù)與體內(nèi)數(shù)據(jù)相關(guān)。例如，對具有不同F(xiàn)cRn結(jié)合動(dòng)力學(xué)的IgG1Fc工程變體進(jìn)行HERA篩選，揭示了與人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠（圖4C)。在最近的一項(xiàng)研究中，HERA被用于解決不同含IgG1Fc的生物制劑進(jìn)行細(xì)胞再循環(huán)的效率，這與轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究相結(jié)合，暗示了與具有相應(yīng)特異性的單克隆IgG1抗體相比，IgG1Fc融合體半衰期明顯短的根本原因。重要的是，該研究還解決了回收和轉(zhuǎn)胞吞作用之間的差異，這可以通過將回收測定與transwell研究相結(jié)合來揭示。后者允許量化FcRn介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)，與回收相反，這與清除率增加相關(guān)。

圖4.人內(nèi)皮循環(huán)測定（HERA）作為體外藥代動(dòng)力學(xué)評估和解決FcRn靶向策略的工具

為了實(shí)現(xiàn)上述細(xì)胞檢測的全部效用，需要考慮生物制劑的生物物理特性。Fc融合結(jié)構(gòu)的表面電荷等因素可能以FcRn依賴性和獨(dú)立方式影響生物制劑的細(xì)胞處理。此外，HERA和其他細(xì)胞檢測也可用于解決基于白蛋白的分子的轉(zhuǎn)運(yùn)問題，這反映了它們的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特性和交叉極化粘膜上皮細(xì)胞表面的能力。

【NO.8】小鼠臨床前藥代動(dòng)力學(xué)評估

雖然細(xì)胞檢測可以指導(dǎo)有限的主要生物候選藥物的選擇和設(shè)計(jì)，但隨后必須在可靠的動(dòng)物模型中評估候選藥物的體內(nèi)行為。雖然非人類靈長類動(dòng)物與人類生物學(xué)非常相似，但它們用于早期發(fā)育受到成本、可及性和道德問題的限制。因此，首選使用較小的動(dòng)物，如老鼠。然而，此類研究應(yīng)仔細(xì)規(guī)劃，并考慮小鼠和人類之間的跨物種結(jié)合和表達(dá)差異。這些轉(zhuǎn)基因小鼠是當(dāng)今基于人IgG的生物制劑藥代動(dòng)力學(xué)評估的金標(biāo)準(zhǔn)，重要的是，其中生成的數(shù)據(jù)與來自非人類靈長類動(dòng)物和臨床觀察的數(shù)據(jù)相關(guān)。

小鼠抗體藥代動(dòng)力學(xué)研究的一個(gè)重要但基本上被忽視的方面是它們的內(nèi)源性IgG水平異常低，這是由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施所需的無病原體外殼產(chǎn)生的。同樣，不同物種的白蛋白結(jié)合也存在很大差異。

【NO.9】生物制劑的細(xì)胞株開發(fā)和生產(chǎn)

大多數(shù)生物制劑是直接注射到患者體內(nèi)的昂貴治療劑。因此，以高效、安全和可重復(fù)的方式生產(chǎn)它們至關(guān)重要。使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)市售抗體治療藥物是最常見的，但生物制劑也可以在細(xì)菌、酵母和無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中制造。通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行生產(chǎn)通常涉及數(shù)十億個(gè)活細(xì)胞，并且要控制和可靠地大規(guī)模復(fù)制所涉及的復(fù)雜生物過程是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。因此，我們投入了大量精力來開發(fā)用于生產(chǎn)生物制劑的理想細(xì)胞系，這些細(xì)胞系能夠以高產(chǎn)量穩(wěn)定表達(dá)產(chǎn)品60代以上，并在高度可重復(fù)的工藝中保持一致的產(chǎn)品質(zhì)量。由于這些努力，生產(chǎn)細(xì)胞系的開發(fā)在過去幾十年中得到了改進(jìn)。從蛋白質(zhì)表達(dá)基因的隨機(jī)整合開始，然后對高產(chǎn)克隆進(jìn)行廣泛篩選到更具針對性的方法，包括靶向基因整合以實(shí)現(xiàn)可重復(fù)的生長和產(chǎn)量以及插入更大的遺傳元件獲得穩(wěn)健的高產(chǎn)細(xì)胞系，并結(jié)合多種細(xì)胞工程策略以獲得一致的產(chǎn)品質(zhì)量。

盡管高產(chǎn)和穩(wěn)健的細(xì)胞系開發(fā)方法在過去幾十年中取得了長足的進(jìn)步，但生物制劑的高效生產(chǎn)仍然是一個(gè)持續(xù)的挑戰(zhàn)。一個(gè)促成因素是生物制劑的復(fù)雜性日益增加，例如異源蛋白，這會(huì)導(dǎo)致額外的細(xì)胞應(yīng)激和潛在的細(xì)胞死亡。另一個(gè)挑戰(zhàn)是生物制劑表達(dá)系統(tǒng)的變化，這通常發(fā)生在早期研究階段和后期細(xì)胞系開發(fā)階段之間。瞬態(tài)人類表達(dá)系統(tǒng)通常是早期的首選，因?yàn)樯a(chǎn)可加工產(chǎn)品數(shù)量的容易和快速，而穩(wěn)定的CHO細(xì)胞系是商業(yè)生產(chǎn)的首選。這種變化會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量存在巨大差異（例如，糖基化、聚集、蛋白質(zhì)折疊），這意味著在商業(yè)生產(chǎn)之前，需要在新的表達(dá)系統(tǒng)中徹底重新表征產(chǎn)品。在細(xì)胞系開發(fā)過程中，經(jīng)常會(huì)遇到產(chǎn)品產(chǎn)量低和產(chǎn)品質(zhì)量變化等問題，這些問題可能會(huì)損害療效、質(zhì)量和患者安全。

在藥物開發(fā)過程中越早考慮細(xì)胞系開發(fā)，成功生產(chǎn)的機(jī)會(huì)就越高。大量研究表明，不良的生物物理特性（例如聚集傾向）通常與穩(wěn)定細(xì)胞系的低效生產(chǎn)有關(guān)，這強(qiáng)調(diào)了使用生物物理特性預(yù)測工具作為早期可制造性指標(biāo)的重要性。通過使用結(jié)合早期產(chǎn)品評估和穩(wěn)定細(xì)胞系生成的強(qiáng)大而靈活的細(xì)胞系開發(fā)平臺(tái)，也可以增加成功生產(chǎn)的機(jī)會(huì)。在這方面，具有可預(yù)測高產(chǎn)量的靶向整合平臺(tái)具有強(qiáng)大的潛力，從發(fā)現(xiàn)到商業(yè)生產(chǎn)，生物制劑可以在同一細(xì)胞系中生產(chǎn)。例如，可以通過擁有不同糖工程細(xì)胞系的庫來增加靈活性，從中可以研究和選擇決定生物制劑穩(wěn)定性、血漿半衰期和免疫原性的所需糖基化譜。然后，提供產(chǎn)品所需糖基化曲線的細(xì)胞系可以直接用于大規(guī)模生產(chǎn)。

【NO.10】口服抗體

迄今為止，大多數(shù)獲批的生物制劑都是以注射劑的形式提供的，因此，分子進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并在循環(huán)系統(tǒng)或組織中發(fā)揮其活性。然而，正在探索替代方法，特別是對抗胃腸道（GI）感染的方法。對于此類生物制劑，可開發(fā)性方面與注射分子同樣重要。然而，雖然血漿半衰期和免疫原性等特性是靜脈注射生物制劑的關(guān)鍵因素，但其他方面，如胃腸道的穩(wěn)定性和保質(zhì)期，對于在GI道中發(fā)揮其功能的口服生物制劑來說更為重要。此外，不同的質(zhì)量參數(shù)，例如產(chǎn)品純度和其他蛋白質(zhì)的存在，對于口服生物制劑來說可能不太重要，因?yàn)槲改c道通常會(huì)遇到各種大分子。

在某些情況下，生物制劑的生物物理穩(wěn)定性可以在發(fā)現(xiàn)過程中或通過后續(xù)的蛋白質(zhì)工程工作進(jìn)一步優(yōu)化。在納米抗體的情況下，一種方法涉及細(xì)胞內(nèi)選擇，這已被證明可以選擇具有更高穩(wěn)定性的納米抗體。隨后可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在篩選過程之前將納米抗體置于高溫下，從而能夠識(shí)別具有更高復(fù)性能力的納米抗體。以及蛋白質(zhì)工程工作，通過在相對的β鏈之間引入額外的二硫鍵，納米抗體在高溫和蛋白酶下進(jìn)一步穩(wěn)定。

最后，當(dāng)生物制劑要口服給藥時(shí)，可以考慮使用替代表達(dá)系統(tǒng)，例如微生物發(fā)酵、使用藻類或轉(zhuǎn)基因植物，甚至通過工程細(xì)胞進(jìn)行原位生產(chǎn)。這種系統(tǒng)有可能降低生物制劑的生產(chǎn)成本和時(shí)間，從而擴(kuò)大此類分子的應(yīng)用范圍。

【NO.11】總結(jié)

最近，生物制劑的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)發(fā)生了轉(zhuǎn)變，從主要關(guān)注對靶標(biāo)的高親和力和特異性、擊中正確的表位和傳達(dá)所需的功能，到現(xiàn)在也考慮可開發(fā)性方面。這種拓寬的發(fā)現(xiàn)和多維工程思維可能會(huì)產(chǎn)生更好的候選藥物，并減少藥物開發(fā)過程中后期失敗的數(shù)量。然而，在許多情況下，尤其是對于全新的生物制劑類型，什么是良好的可開發(fā)性并不總是很清楚，盡管這種特征的一些例子（例如，市售的藥物相似性和治療性抗體分析工具）開始出現(xiàn)。隨著更多的序列信息和生物物理數(shù)據(jù)公開可用，建立可開發(fā)性指導(dǎo)原則的任務(wù)變得越來越容易。在這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)，我們預(yù)計(jì)計(jì)算機(jī)預(yù)測將在發(fā)現(xiàn)過程的早期發(fā)揮越來越大的作用，因?yàn)樗鼈冊试S以低成本（一旦建立）進(jìn)行非常高通量的分析。然而，由于現(xiàn)有數(shù)據(jù)集的偏差，使用計(jì)算機(jī)模型可能會(huì)帶來一些固有的不確定性，重新評估算法以及擴(kuò)展現(xiàn)有數(shù)據(jù)集和構(gòu)建新數(shù)據(jù)集將繼續(xù)很重要。在生成這些數(shù)據(jù)集的過程中，包括和探索可能無法預(yù)測具有卓越成藥性特征的分子可能是有益的。

另一個(gè)復(fù)雜之處在于，一些生物物理特性本質(zhì)上是動(dòng)態(tài)的，例如聚集和部分展開，因此計(jì)算機(jī)模擬方法能夠?qū)⒎肿有袨榧{入其預(yù)測中可能很重要。例如，由于結(jié)構(gòu)模型并不總是精確的，因此可能需要考慮這一點(diǎn)的模擬作為穩(wěn)態(tài)模型的補(bǔ)充，以提高生物物理預(yù)測的準(zhǔn)確性和可靠性。為了進(jìn)一步改進(jìn)用于開發(fā)最佳生物制劑的計(jì)算機(jī)方法，需要基于知識(shí)和基于物理的方法。開發(fā)可靠的計(jì)算機(jī)模型的另一個(gè)障礙是缺乏自洽和可重復(fù)的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)是從使用類似方案和儀器在類似條件下對大量分子進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中獲得的。生物制藥行業(yè)正在進(jìn)行的數(shù)字化轉(zhuǎn)型有望緩解這一困難，并促進(jìn)改進(jìn)的人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)方法的產(chǎn)生。最后，在競爭前空間內(nèi)，工業(yè)界和學(xué)術(shù)界之間形成協(xié)作聯(lián)盟，為機(jī)器學(xué)習(xí)提供自洽和可重復(fù)的數(shù)據(jù)，這將是改進(jìn)計(jì)算機(jī)方法和模型的又一大步。

除了計(jì)算機(jī)方法外，我們預(yù)計(jì)生物物理方法將繼續(xù)在評估可開發(fā)性措施方面發(fā)揮作用。自動(dòng)化、小型化和數(shù)字化是藥物開發(fā)的主要趨勢。結(jié)合新型體外檢測，這可能會(huì)在新生物制劑的發(fā)現(xiàn)過程的早期實(shí)現(xiàn)更強(qiáng)大、更智能的篩選和表征。然而，這一領(lǐng)域的挑戰(zhàn)仍然存在。雖然擁有強(qiáng)大的發(fā)現(xiàn)引擎可能是開發(fā)新生物制劑的主要優(yōu)勢，但建立這種能力并教育人員使用先進(jìn)系統(tǒng)既復(fù)雜又昂貴。此外，隨著藥物變得越來越定制化和個(gè)性化，需要提高大型發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的多功能性和模塊化，以便它們不僅經(jīng)過優(yōu)化以發(fā)現(xiàn)針對單一適應(yīng)癥的模式。

有助于生物制劑開發(fā)的另一種途徑是生成和使用動(dòng)物模型，以更好地反映臨床環(huán)境以及生物制劑在人類中的表現(xiàn)。在這方面，一些重要方面包括藥代動(dòng)力學(xué)、免疫原性、療效和效應(yīng)器功能的參與。

由于生物制劑的制造通常是復(fù)雜的分子，因此優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)和純化方法以實(shí)現(xiàn)可重復(fù)、可重復(fù)的高質(zhì)量材料生產(chǎn)非常重要。這涉及產(chǎn)量優(yōu)化、折疊、翻譯后修飾（如糖基化）和宿主細(xì)胞蛋白的還原。在這里，預(yù)計(jì)糖工程將繼續(xù)發(fā)揮重要作用，我們預(yù)計(jì)在發(fā)現(xiàn)過程的早期考慮糖基化模式（和其他翻譯后修飾）可能會(huì)提高許多基于蛋白質(zhì)的生物制劑的成功率。然而，在這一領(lǐng)域，仍有許多未知數(shù)，重要的是更好地建立知識(shí)和指南，以便不僅使生物制劑具有類似人類的翻譯后修飾，而且還具有比相應(yīng)的人類修飾更好的修飾。

最后，值得一提的是，迄今為止大多數(shù)生物制劑都是作為注射劑給藥的。未來，預(yù)計(jì)會(huì)有更多的生物制劑通過口服、肺部途徑或其他途徑給藥。這無疑將對新生物制劑的開發(fā)和配制方式產(chǎn)生影響，并可能允許使用全新的生產(chǎn)系統(tǒng)。

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