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Introduction

核磁共振（NMR）和質譜（MS）可為靶向分離、鑒定和代謝組學提供豐富的分子結構信息，極大地促進了從植物、微生物和海洋來源發現天然產物（NPs）的過程。在過去的幾十年里，隨著NMR和MS技術在食品領域的出版物數量逐年穩步增加表明上述技術在食品科學領域的多樣化應用已擴展到食品質量、食品化學、食品營養、食品微生物學等廣泛的食品基質中。當這2 種技術應用于代謝組學研究時，它們也具有獨特的優勢。因此，長期以來，NMR和MS技術的結合一直被用于新的代謝物的結構表征，特別是在NPs領域。NPs由于其復雜的骨架結構、獨特的性質和多種生物活性，長期以來一直被認為是藥物開發先導化合物的重要來源。傳統的NPs發現過程成本高、耗時長、缺乏導向性。此外，分離的盲目性導致重復發現已知成分和生物活性喪失。功能性食品，尤其是植物性膳食補充劑，不僅提供多種營養和功能化合物（FCs），而且對人體健康具有多種生物活性益處。隨著健康意識的提高和人口老齡化帶來的挑戰的增加，對個人健康有益的功能食品越來越受到研究人員的關注。開發天然植物源性功能食品，需要對FCs進行篩選和科學研究，對其安全性、功能性、量效關系乃至分子機制進行評價。機器學習（ML）算法是人工智能（AI）的子領域，越來越多地被用于開辟新的機會來解決FCs發現的挑戰。如何快速有效地識別、篩選和挖掘FCs和NPs結合AI/ML算法也是研究的關鍵十字路口。現代光譜儀靈敏度的顯著提高將有助于小分子化合物的挖掘，并減少數據采集所需的時間，特別是多維核磁共振。近年來，隨著代謝組學、生物信息學和AI的快速發展，NPs的發現正在發生范式轉變。新的基于核磁共振和質譜的鑒定和反復制策略正在出現并應用于FCs和NPs領域。例如，基于MS/MS分子網絡（MN）的GNPS平臺在食物相關代謝組學研究中越來越普遍。無監督（即層次聚類分析（HCA）、主成分分析和判別分析（PCA-DA）和監督ML算法（即偏最小二乘、正交投影到潛在結構（OPLS）、隨機森林、支持向量機和人工神經網絡）已被用于從代謝組學數據中提取信息，并產生新的生物學見解。基于目前的研究現狀，本文重點總結了新興的核磁共振和質譜技術在快速準確地識別包括FCs在內的NPs中的應用，以期為FCs的挖掘提供更好的見解和思路。

圖1 基于MS和NMR技術NPs和FCs的發現簡介

Results and Discussion

用于FCs和NPs化學信息分析的NMR技術

核磁共振被認為是靶向和非靶向代謝組學中闡明結構、解析FCs和NPs不可或缺的工具。基于核磁共振的復雜混合物代謝組挖掘為發現不同結構類型的NPs提供了機會。此外，核磁共振通常對結構獨特性和新穎性特征敏感，對同分異構體和結構相似的化合物有很高的鑒別力，而且儀器與儀器之間的差異最小。然而，與MS相比，其局限性在于信號重疊和靈敏度較低，尤其是在復雜樣品中，這意味著需要更多的樣品。不過，隨著高場和超高場NMR儀器、超低溫探頭的出現大大提高了NMR的分辨率和靈敏度。這使能夠處理微克級的較小樣本量，并縮短測試時間。此外，通過獲取二維NMR數據集（COSY、TOCSY、HSQC、HMBC），樣品1H NMR光譜中較為普遍的信號重疊問題得到了部分解決，這為闡明代謝物的結構提供了關鍵信息。在此，重點介紹食品和植物領域中基于核磁共振技術的新興的定性、靶向分離和去重復策略，這些策略在食品質量評估、FCs挖掘和新穎NPs發現方面發揮著關鍵作用。

MixONat（見https://sourceforge.net/projects/mixonat）是一款免費發布的算法軟件，用于根據13C NMR光譜數據去重復混合物。13C NMR可選擇與DEPT-135和DEPT-90方法相結合，用于破譯混合物的復雜性，以區分碳類型，進行預測性或實驗性碳化學位移比較，同時將碳多重性過濾作為一個關鍵步驟。使用MixONat軟件的一般程序（圖 2）是將復雜的NP混合物進行13C NMR和DEPT處理，以區分CH3、CH2和CH以及C碳類型。然后，以SDF文件格式從結構數據庫中收集的感興趣的NPs與13CNMR的實驗化學位移值進行匹配，并對分子量和碳類型進行過濾。最后，可在數據庫中標出各種化合物的相似性得分，用于化合物注釋。

圖2 應用MixONat策略總體流程圖

另一種基于13C NMR的去重復策略已被引入特定的代謝組學衍生工作流程（圖3），用于直接鑒定混合物中的代謝物。Hubert等利用離心分離萃取（CPE）將復雜代謝物混合物的化學成分簡化為一系列連續的餾分。然后利用13C NMR、自動收集和配準對這些餾分中所含的全部代謝物進行分析。通過HCA生成“化學位移簇”，以確定餾分中代謝物的化學位移相似性，并將其分配到分子結構中。目前已建立了一個內部13C NMR天然代謝物化學位移數據庫，通過與文獻中先前描述的與所研究提取物有關的化合物進行比較，可幫助鑒定過程。

圖3 基于CPE和HCA方法的一種利用13C NMR數據的去重復策略

SMART是一種基于AI/ML的工具（http://smart.ucsd.edu/classic），用于從HSQC數據（圖 4）中生成結構假設，從而將新分離的NPs與其已知類似物快速聯系起來。Zhang等利用非均勻采樣（NUS）和深度卷積神經網絡（CNN）開發了這一高效發現NPs的策略。該技術利用神經網絡架構，在一個由2054 種NPs的HSQC光譜組成的數據集上訓練深度卷積網絡，關鍵相關信號次數達83 000 次。這種模型構建了一個能夠區分光譜相似性的聚類空間，其中結構相似的化合物聚集在一起，而結構不同的化合物則相距甚遠。隨后，通過NUS序列快速獲取混合物的HSQC圖譜，然后提交給上述經過訓練的深度CNN卷積神經網絡進行區分分析。

圖4 基于HSQC分析的SMART策略的總體流程圖

基于MS的FCs和NPs發現策略

分子網絡（MN）由Dorrestein課題組于2012年首次提出，隨后成為分析基于MS2的代謝組學數據的流行工具。它是一種質譜網絡可視化策略，通過整合MS2光譜、生物信息學和計算算法而開發。MN的原理是，在相同條件下，具有相似或相同結構的分子會顯示出相似或相同的MS2光譜。在比較MS2圖譜中的每個離子碎片峰時，會用余弦值（0~1）計算每個圖譜的相似度。譜圖的相似度越高，計算出的余弦值就越大。根據計算出的余弦值，相似的光譜可以集中在一起，反之則可以單獨分組。最終，所有的MS2光譜都被整合到一個可視化的MN圖中。通過與已知化合物標準MS2數據庫進行比對，可以從復雜樣品中找出具有m/z值的已知化合物節點，從而將MS信息與樣品結構特征聯系起來。基于網絡的非靶向代謝組學工作流程由3 個關鍵步驟組成：數據預處理、網絡可視化和代謝物注釋。在MN圖中，每個節點代表一個化合物，相應的MS2圖譜信息可以用節點名稱、顏色、大小、形狀等特征來表示。節點之間的邊表示不同化合物之間的結構關系，線的粗細表示這種關系的余弦值。隨著代謝組學的不斷發展，越來越多基于MN的工具被開發出來。這些基于MN的工具可用于MS2數據集的處理和可視化，也可用于數據庫的自動搜索，以識別具有特定結構的FCs。它們極大地促進了復雜代謝組學數據的分析和解讀，使研究人員能夠探索不同化合物之間的關系，深入了解它們的功能和生物學意義。

GNPS分析中基于特征的MN分子網絡（FBMN）策略：在基于MS2的非靶向代謝組學樣本中，經典MN可提供大量代謝物。然而，這種方法的主要瓶頸在于色譜解卷積必須進行人工后處理，而且會出現多個嵌合譜節點。FBMN利用成熟的MS處理軟件包，如MZmine、XCMS、MS-DIAL或OpenMS，通過整合MS1信息（包括同位素模式和保留時間）和離子淌度分離，改進了傳統的MN方法（圖 5）。FBMN可以區分異構體，而這些異構體在經典MN中可能是隱蔽的，從而有助于譜圖注釋和相對定量信息。不過，在尋找特征的過程中存在忽略痕量代謝物的問題，進一步優化預處理參數可在一定程度上減少這一問題。

圖5 經典分子網絡策略和FBMN策略總體流程

GNPS分析中基于分子砌塊的MN分子網絡（BBMN）：分子砌塊作為特定的分子支架，以構建各種FCs為基礎。生物體基因組包含構建、連接和修飾砌塊的指令。利用MS2譜圖數據識別代謝組學的基本分子砌塊是提高代謝組學工作流程注釋能力的一種有前途的方法，因為它有助于識別結構并根據這些分類對代謝物進行分組。這種BBMN策略由He等提出，可以通過標記保守的MS2片段來識別具有特定亞結構的化合物。GNPS分析中的離子特性MN分子網絡（IIMN）：在經典的MN和FBMN分析中，特定化合物的非連接加成離子是一個核心瓶頸。例如，在LC-MS離子化過程中，譜庫中最常見的2 種離子（[M+H]+和[M+Na]+）通常是不相連的，在MN中顯示為單獨的節點。因此，對于復雜的代謝物來說，基于MS2數據的MN所構建的特征是高度冗余的。離子識別分子網絡（IIMN）于2021年首次提出，是一種基于規則的數據分析工作流程（圖 6），展示了如何將基于MS2的光譜網絡與基于MS1特征形狀相似性的附加網絡（源自同一分子的加成離子）合并。它利用前體離子符合保留時間、峰形和用戶定義參數的MS2圖譜來補充FBMN。

圖6 BBMN策略和IIMN策略總體流程圖

Conclusion

在本文中，總結了新出現的基于NMR和MS的高效策略及其在功能食品和NPs領域研究中的應用。事實上，核磁共振的獨特優勢在很大程度上可與質譜互補，且越來越多的代謝組學研究報告了兩者的結合使用從而改進代謝物鑒定和化合物注釋的數據整合策略。因此，通過集成平臺結合使用基于NMR和MS的常規技術是一種高效的選擇，可通過使用多個數據集集成來提高代謝組的覆蓋率、促進功能基因組注釋并建立更強大的模型。從硬件組合到計算工具（如SUMMIT MS/NMR、NMR/MS Translator和DAF discovery），一些綜述討論了將NMR和MS結合用于代謝組學的各種方法，這使得在無需分離復雜基質的情況下闡明結構和化學位移非常相似的FCs變得可行。作者認為，這一觀點將有助于激發FCs的發現，并增強NPs研究領域的信心。在此，本文建議對最初提取的樣品進行全面的二維NMR和MS2分析，以便以互補的方式在兩種技術之間建立橋梁。另一方面，大多數基于NMR和MS的策略都涉及在計算算法中將光譜數據與數據庫進行比較。FCs鑒定的準確性取決于數據庫中包含的結構類型和數量，這就造成了實際限制。因此，應該指出的是，隨著數據庫和軟件工具的擴大、整合和開發將使大規模數據分析和注釋變得更加容易。

與MS方法相比，核磁共振為分子分析提供了更多的結構信息，但溶劑效應、采集時間長和信號重疊等不可忽視的局限性阻礙了新的核磁共振引導策略的發展。如何面對這些挑戰，制定促進代謝物注釋的新策略，是需要重點關注和解決的問題。NOAH（使用1H檢測的有序采集NMR）作為一種超序列方法被提出，它在每次采集中結合了多個異核和同核相關性，在基于1H檢測的同一實驗中采集不同的2D NMR數據，這在很大程度上減少了NMR采集時間和成本。NUS的設計還能減少間接維度的實驗次數，從而在減少數據采集實驗的同時提供對全采樣頻譜的精確估計。

MN主要用于發現NPs，其應用已擴展到多個領域，包括藥物先導物發現、臨床診斷和法醫分析。經典的MN和FBMN現已廣泛應用于非靶向代謝組學研究、食品真偽鑒別和食品化學研究，并在準確挖掘FCs方面顯示出巨大的潛力。隨著色譜分離能力和質譜靈敏度的不斷提高，大量的MS2數據將獲得，因此數據處理和不同形式的加成離子已成為挑戰。隨著FCs和生物活性NPs的不斷挖掘，基于MN的工具和方法目前正在經歷一場小型革命。盡管新出現的基于MN的方法經過精細的算法修改后已顯示出NPs鑒定的強大潛力，但需要更多的案例研究來驗證，因此需要確認數據質量并提高FCs注釋的準確性。盡管注釋的可靠性仍需人工排序，而且數據庫中的結構數量有限，注釋策略已顯示出過濾大型數據集的能力。今后，應繼續努力開發新的策略，借助于AI/ML輔助決策支持工具和現有分子數據的發展，擴大代謝物的覆蓋范圍，提高FCs挖掘的數據質量。

第一作者簡介

張伯斗，碩士畢業于中國藥科大學中藥學專業，現為中國科學院昆明植物研究所在讀博士研究生。主要研究方向為構建基于質譜和核磁技術的融合體系挖掘具有重要生理功能的活性天然產物。目前以第一作者在Phytochemistry，Journal Ethnopharmacology，Food Science and Human Wellness發表SCI論文3篇。

通信作者簡介

張于，博士，中國科學院特聘研究員，中國科學院昆明植物研究所博士研究生導師，專題攻關組組長，美國北卡羅萊納大學教堂山分校藥學院訪問學者，云南省中青年學術和技術帶頭人、云南省萬人計劃青年拔尖、中國科學院青年創新促進會會員、中國科學院西部之光—西部青年學者，Food Science and Human Wellness和Natural Products and Bioprospecting期刊編委，主要從事天然產物化學研究工作，重點關注中藥/藥用/食用植物中天然產物結構、活性、作用機制以及成藥性研究，目前運用質譜和核磁技術分離鑒定1 000余個天然產物結構，其中新結構200余個。目前以第一或通信作者在Protein & Cell, Organic Letters, Journal of Natural Products，Food Science and Human Wellness等權威期刊發表SCI論文70余篇，授權專利5 項；目前主持國家重點研發計劃課題、國家自然科學基金、云南省應用基礎研究計劃重點等十余項項目，先后獲云南省自然科學一等獎和廣西自然科學二等獎。

The application and perspective of NMR and MS based strategies for functional compounds mining in medicinal and dietary plants

Bodou Zhanga,b, Sheng Lia, Zhenzhen Lianga, Yinling Weia,b, Jing Donga, Hongyan Wena, Lingli Guoa, Xiaojiang Haoa, Yu Zhanga,*

a State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China

b University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

*Corresponding author.

Abstract

Medicinal and dietary plants provide numerous nutritional and functional compounds and also have various potential health benefits to humanity. The specific and efficient techniques for accurate identification of nutritional compounds and functional metabolites is crucial for the development of functional foods from medicinal and dietary plants. Nuclear magnetic resonance (NMR) and mass spectrometry (MS) are indispensable and essential technologies that provide an unsurpassed wealth of untargeted identification, quantitative and qualitative analysis, and structural information in the study of food and plant products. In the past decade, the rapid development of modern analytical technology has led to the emergence of new approaches and strategies for natural products discovery. Especially the application of novel NMR- and MS-based identification and dereplication strategies aided by artificial intelligence and machine learning algorithms have brought about a significant shift in the natural products discovery process. These developments and changes in the natural products filed have given us insights into how to accurately target and mining nutritional, functional, and bioactive compounds. Thus, we have summarized recent research on novel NMR and MS based strategies and methods focusing on functional compounds, accurate identification and efficient discovery mainly in medicinal and dietary plants. This review could provide a comprehensive perspective for a better understanding of novel strategies and methods based on NMR and MS technologies, which could provide valuable insights and ideas for functional compounds mining.

Reference:

ZHANG B D, LI S, LIANG Z Z, et al. The application and perspective of NMR and MS based strategies for functional compounds mining in medicinal and dietary plants[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 14(1): 9250003. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250003.

文章翻譯由作者提供

編輯：王佳紅；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創意

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