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Abstract

腸道微生物群在抑郁癥的病理生理學中起著關(guān)鍵作用。本研究旨在探究成熟完整的酸橙果實提取物（FEMC）在慢性不可預測溫和應(yīng)激（CUMS）小鼠模型中的抗抑郁作用。通過行為學測試來評估其抗抑郁效果，并運用16S rRNA測序技術(shù)分析腸道微生物群的變化情況。結(jié)果顯示，成熟完整酸橙果實提取物的主要成分是柚皮苷和新橙皮苷，并且它能顯著提高小鼠的蔗糖偏愛指數(shù)。成熟完整酸橙果實提取物還可以縮短小鼠在開放場試驗中的進食潛伏期，以及在新奇抑制進食實驗中的靜止時間。此外，成熟完整酸橙果實提取物能夠增加因慢性不可預測溫和刺激應(yīng)激導致的小鼠海馬體中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、突觸后致密蛋白95（PSD95）和突觸素（SYN）水平的降低。再者，成熟完整酸橙果實提取物干預輕微降低了厚壁菌門與擬桿菌門的比例。同時，成熟完整酸橙果實提取物減少了普雷沃氏菌科_Ga6A1_組、[瘤胃球菌]_torques_組的豐度，據(jù)報道這些菌群與炎癥密切相關(guān)。生物信息學分析表明，MAPK信號通路和脂多糖生物合成參與了成熟完整酸橙果實提取物在慢性不可預測溫和刺激動物模型中的抗炎作用。最后，ELISA結(jié)果顯示，成熟完整酸橙果實提取物能夠顯著降低抑郁小鼠血清中促炎細胞因子IL-6和TNF-α的表達。研究結(jié)果表明，成熟完整酸橙果實提取物可以通過抑制腸道微生物群介導的炎癥來改善小鼠的抑郁行為。

Introduction

酸橙主要生長在中國長江流域及南方地區(qū)。酸橙已被歸類為食品的調(diào)味劑和酸化劑。從歷史上看，酸橙，即酸橙的未成熟果實，在傳統(tǒng)中醫(yī)中被用于治療胃腸道疾病，并作為一種抗抑郁藥物使用，這在很大程度上與其中的生物活性黃酮類化合物有關(guān)。近年來，成熟的酸橙因其藥用價值和特殊風味而成為主要的研究焦點。在加工成熟果實果汁時，酸橙的果皮通常會作為廢物被處理掉。然而，許多先前的研究表明，柑橘類果皮含有大量的黃酮類化合物，包括橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷和多甲氧基黃酮（PMFs），這些黃酮類化合物具有不同的藥用特性，如抗氧化、抗炎、抗癌和抗菌作用，并且可以緩解心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病。在此基礎(chǔ)上，已經(jīng)開展了一些研究，利用完整的柑橘類果實制作果汁并提高其營養(yǎng)價值。

抑郁癥是最常見的慢性疾病之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，全球有超過3.5億人飽受抑郁癥困擾，且每年呈高增長率。抑郁癥的特征表現(xiàn)為食欲不振、情緒低落、缺乏活力、悲傷以及失眠，在極端情況下，甚至會導致自殺。抑郁癥不僅嚴重影響患者及其家庭的日常生活，也給社會帶來了沉重負擔。此外，在不同類型的抑郁癥中，廣泛的認知功能會遭受嚴重損害，其中一個顯著特征是學習和記憶困難。然而，臨床研究表明抑郁癥患者的治療效果并不理想，因此，在日常飲食中尋找能夠改善抑郁癥的天然成分并闡明其作用機制或許具有重要意義。

酸橙對抑郁癥具有預防和治療作用。目前的研究表明，酸橙通過增加BDNF的表達來發(fā)揮抗抑郁作用，BDNF可以保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS），并參與調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)等途徑。徐等人研究了酸橙乙醇提取物（FAIEE）對慢性不可預測溫和應(yīng)激小鼠的抗抑郁樣作用，發(fā)現(xiàn)與慢性不可預測溫和刺激組相比，酸橙乙醇提取物顯著改善了小鼠的抑郁樣行為，并且在中、高劑量組中，BDNF mRNA和蛋白質(zhì)的表達顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，酸橙乙醇提取物的抗抑郁樣作用可能與海馬體BDNF mRNA表達的增加有關(guān)。

酸橙能夠通過保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)來減輕抑郁癥等癥狀。吳等人發(fā)現(xiàn)，酸橙乙醇提取物顯著縮短了小鼠在強迫游泳實驗和懸尾實驗中的不動時間，這表明它具有抗抑郁的效果。此外，研究人員使用酸橙乙醇提取物的主要成分（橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素和新橙皮苷）來研究其對皮質(zhì)酮誘導的PC12細胞神經(jīng)毒性的神經(jīng)保護作用。結(jié)果顯示，這4種成分組的細胞活性均顯著提高，并且這四種成分的神經(jīng)保護作用呈現(xiàn)出劑量依賴性。這些研究結(jié)果表明，酸橙的抗抑郁作用可能與其對細胞的神經(jīng)保護作用有關(guān)，而且這四種成分可能是其主要的有效物質(zhì)。

腸道微生物群與抑郁癥密切相關(guān)。越來越多的研究表明，腸道微生物群廣泛涉及神經(jīng)退行性疾病、認知功能障礙、情緒紊亂等疾病，對人類健康與疾病有著重大影響。腸道微生物群在調(diào)節(jié)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面發(fā)揮著重要作用，影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，并參與許多精神疾病的發(fā)病機制；此外，腸道微生物群可通過微生物-腸-腦軸調(diào)節(jié)宿主的大腦功能和行為，包括焦慮、情緒及認知。微生物群異常以及微生物-腸-腦軸功能失調(diào)可能是抑郁癥的直接病因和潛在影響因素，而糾正這些紊亂或許是預防和治療抑郁癥的有效途徑。黃酮類化合物能夠通過腸-腦軸調(diào)節(jié)腸道微生物群的類型和結(jié)構(gòu)。然而，目前尚未有關(guān)于成熟完整酸橙果實提取物通過調(diào)節(jié)腸道微生物群發(fā)揮抗抑郁作用的報道。因此，本研究旨在通過高效液相色譜（HPLC）分析完整酸橙果實提取物的成分，利用行為學測試和蛋白質(zhì)免疫印跡分析探究完整酸橙果實提取物的抗抑郁活性，并研究在慢性不可預測溫和刺激誘導的小鼠抑郁模型中完整酸橙果實提取物對腸道微生物群的調(diào)節(jié)功能。

圖1 實驗程序

Results

成熟完整酸橙果實提取物緩解了慢性不可預測溫和應(yīng)激誘導的類似抑郁行為

為了研究成熟完整酸橙果實提取物對慢性不可預測溫和應(yīng)激誘導的類似抑郁行為的影響，進行了蔗糖偏愛測試、進食潛伏期測試和曠場測試。如圖2所示，與對照組相比，慢性不可預測溫和刺激組的蔗糖偏愛指數(shù)和活動時間顯著降低，而進食潛伏期和靜止時間顯著增加，這表明慢性不可預測溫和刺激模型成功建立。在慢性不可預測溫和刺激應(yīng)激期間給予不同劑量的成熟完整酸橙果實提取物（75、150、300 mg/kg）處理后，中劑量組（M-成熟完整酸橙果實提取物）和高劑量組（H-成熟完整酸橙果實提取物）的蔗糖偏愛指數(shù)顯著增加，同時進食潛伏期顯著縮短。此外，與慢性不可預測溫和刺激組相比，各劑量組的活動時間呈梯度增加，靜止時間呈梯度減少，且中劑量組和高劑量組差異顯著。作為陽性對照的氟西汀組也有顯著差異。

圖2 成熟完整酸橙果實提取物對慢性不可預測溫和應(yīng)激小鼠類似抑郁行為的影響

成熟完整酸橙果實提取物增加了海馬體組織中BDNF、PSD95和SYN的表達

蛋白質(zhì)免疫印跡分析（圖3）顯示，與對照組相比，慢性不可預測溫和應(yīng)激組中BDNF、PSD95和SYN的表達水平顯著降低。給予成熟完整酸橙果實提取物能夠逆轉(zhuǎn)這些表達水平的下降，并且在劑量為300mg/kg時表現(xiàn)出顯著差異。作為陽性對照的氟西汀組也有顯著差異。

圖3 成熟完整酸橙果實提取物對海馬體組織中BDNF、PSD95以及SYN表達的影響

成熟完整酸橙果實提取物調(diào)節(jié)微生物群的結(jié)構(gòu)和組成

為了研究成熟完整酸橙果實提取物對腸道微生物群的調(diào)節(jié)作用，通過16S rRNA對對照組、慢性不可預測溫和應(yīng)激組以及高劑量成熟完整酸橙果實提取物組的小鼠糞便腸道微生物群進行了分析。從15個樣本中獲得了相似度為97%的15535個操作分類單元（OTUs）。維恩圖展示了每組中OTUs的數(shù)量以及重疊情況，結(jié)果表明每個樣本總共擁有3593個OTUs（圖4A）。

從等級豐度分析、物種累積曲線分析以及α-稀疏度分析來看，本研究中的測序數(shù)量足以涵蓋樣本中的所有分類單元，這表明測序深度是合適的（圖4B-D）。在進行主坐標分析（PCoA）和主成分分析（PCA）后，觀察到對照組、慢性不可預測溫和應(yīng)激組和高劑量成熟完整酸橙果實提取物組之間的微生物群譜存在明顯的聚類現(xiàn)象（圖4E和F）。層次聚類分析在很大程度上證實了主坐標分析和主成分分析的結(jié)果（圖4G）。這些結(jié)果共同表明，慢性不可預測溫和應(yīng)激顯著改變了腸道細菌的結(jié)構(gòu)；然而，成熟完整酸橙果實提取物處理有效地緩解了腸道細菌種群的巨大變化。正如在α-多樣性分析中所預期的那樣（圖4H和I），與對照組相比，慢性不可預測溫和應(yīng)激組的小鼠在Chao1指數(shù)和觀測物種指數(shù)方面顯示出更高的微生物群多樣性，補充成熟完整酸橙果實提取物在一定程度上可以恢復這種上升趨勢，但各組之間沒有顯著差異，這表明慢性不可預測溫和應(yīng)激明顯增加了分類單元的豐富度和均勻度，而成熟完整酸橙果實提取物干預并沒有顯著提高分類單元的豐富度和均勻度。

圖4 成熟完整酸橙果實提取物對慢性不可預測溫和應(yīng)激小鼠腸道微生物群豐富度和特征的影響

為了評估不同組別的微生物群組成，尤其是在添加了成熟完整酸橙果實提取物后的情況，在門、目和屬的分類水平上分析了細菌分類單元的系統(tǒng)發(fā)育型（圖5A-C）。在門的分類水平上，最豐富的菌門是厚壁菌門和擬桿菌門，它們在對照組、慢性不可預測溫和應(yīng)激組和成熟完整酸橙果實提取物組中占總序列的比例超過94%。從圖5A中可以看出，補充成熟完整酸橙果實提取物也輕微逆轉(zhuǎn)了由慢性不可預測溫和應(yīng)激誘導的厚壁菌門的增加和擬桿菌門的減少，但沒有顯著差異。

圖5 群落豐度占比

成熟完整酸橙果實提取物在逆轉(zhuǎn)一些由慢性不可預測溫和應(yīng)激誘導的糞便細菌組成變化方面也顯示出了良好的效果，包括在目水平上的克里斯滕森菌目、單球形菌目（圖5B），以及在屬水平上的普雷沃氏菌科_Ga6A1_組、克里斯滕森菌科_R-7_組、單球形菌屬、[真桿菌]_氧化還原菌_組、泥生菌屬、黏膜螺旋菌屬、理研菌屬、[瘤胃球菌]_torques_組、氣球菌屬、毛螺菌科_ND3007_組、丹毒絲菌科_UCG-003和暫定種_Stoquefichus（圖6A-L）。

圖6 代表性屬的豐度

采用線性判別分析效應(yīng)量（LEfSe）方法來分析細菌表型的具體變化。各組之間存在顯著差異的微生物群和分類層次結(jié)構(gòu)如圖7A和B所示。在所有組中共有33個顯著的屬（線性判別分析（LDA）值大于2）。隨機森林分析顯示了這些屬的重要順序（圖7C）。主坐標分析（PCoA）中的R值為0.21247，這表明3個組之間存在顯著差異，這些差異具有統(tǒng)計學意義。

圖7 成熟完整酸橙果實提取物調(diào)節(jié)了慢性不可預測溫和應(yīng)激小鼠腸道微生物群的組成

成熟完整酸橙果實提取物改變了腸道功能

基于KEGG，通過PICRUST2預測了由成熟完整酸橙果實提取物處理引起的腸道功能變化，結(jié)果如圖8所示。微生物群功能預測結(jié)果顯示，不同腸道微生物群的功能主要集中在檸檬酸循環(huán)（三羧酸循環(huán)（TCA）循環(huán)）、脂多糖生物合成、軍團病相關(guān)通路以及泛醌和其他萜類醌生物合成。這些結(jié)果表明，成熟完整酸橙果實提取物在削弱三羧酸循環(huán)和脂多糖生物合成方面表現(xiàn)出更直接的作用能力。

圖8 不同腸道微生物群在KEGG功能通路第三分類水平上豐度排名前十的通路

成熟完整酸橙果實提取物降低了血清中促炎細胞因子的表達

酶聯(lián)免疫吸附測定分析（圖9）顯示，與對照組相比，慢性不可預測溫和應(yīng)激組中IL-6和TNF-α的表達水平顯著升高。給予成熟完整酸橙果實提取物（300 mg/kg）顯著降低了這些促炎細胞因子的表達。

圖9 血清中促炎細胞因子的表達情況

Conclusion

綜上所述，本研究基于慢性不可預測溫和應(yīng)激模型發(fā)現(xiàn)，成熟完整酸橙果實提取物能夠改善由慢性不可預測溫和刺激所導致的抑郁行為，其作用機制可能與抑制小鼠體內(nèi)由腸道微生物群介導的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

Citrus aurantium L. extract alleviate depression by inhibiting gut microbiota-mediated inflammation in mice

Tao Lia, Guirong Zengb, Lingfeng Zhua, Yanyang Wuc, Qun Zhanga, Fuhua Fua, Donglin Sua, Gaoyang Lia, Qili Lia,*, Yang Shana,*

a Hunan Agricultural Product Processing Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China

b Hunan Key Laboratory of Pharmacodynamics and Safety Evaluation of New Drugs, Hunan Provincial Research Drugs Safety Evaluation Research Center, Changsha 410331, China

c College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

*Corresponding author.

Abstract

Gut microbiota plays a crucial role in the pathophysiology of depression. This study aimed to explore the antidepressant effect of mature whole Citrus aurantium fruit extract (FEMC) in the chronic unpredictable mild stress (CUMS) model. The behavioral tests were applied to assess antidepressant effect and 16S rRNA sequencing was used to analyze the changes of gut microbiota. The results showed that the major components of FEMC were naringin and neohesperidin and significantly increased the sucrose preference index of the mice. FEMC also could reduce the feeding latency in an open field test and the rest time in a novelty suppressed feeding test. In addition, FEMC could increase CUMS-induced reduction in the levels of BDNF, PSD95, and SYN in the hippocampus. Moreover, FEMC intervention slightly decreased the ratio of Firmicutes to Bacteroidota. Meanwhile, FEMC reduced the abundance of the Prevotellaceae_Ga6A1_group, [Ruminococcus]_torques_group, which have been reported to be closely related to inflammation. Bioinformatics analysis revealed that mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway and lipopolysaccharide biosynthesis were involved in the anti-inflammatory effect of FEMC in the CUMS animal model. Finally, the ELISA results showed that FEMC could significantly reduce the expression of pro-inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α in the serum of depressive mice. Our results suggest FEMC can ameliorate depressive behavior by inhibiting gut microbiota-mediated inflammation in mice.

Reference:

LI T, ZENG G R, ZHU L F, et al. Citrus aurantium L. extract alleviate depression by inhibiting gut microbiota-mediated inflammation in mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3403-3414. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250025.

翻譯： 王立磊（實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創(chuàng)意

為貫徹落實《中共中央國務(wù)院關(guān)于全面推進美麗中國建設(shè)的意見》《關(guān)于建設(shè)美麗中國先行區(qū)的實施意見》和“健康中國2030”國家戰(zhàn)略，全面加強農(nóng)業(yè)農(nóng)村生態(tài)環(huán)境保護，推進美麗鄉(xiāng)村建設(shè)，加快農(nóng)產(chǎn)品加工與儲運產(chǎn)業(yè)發(fā)展，實現(xiàn)食品產(chǎn)業(yè)在生產(chǎn)方式、技術(shù)創(chuàng)新、環(huán)境保護等方面的全面升級。由 中國工程院主辦， 中國工程院環(huán)境與輕紡工程學部、北京食品科學研究院、湖南省農(nóng)業(yè)科學院、岳麓山工業(yè)創(chuàng)新中心承辦， 國際食品科技聯(lián)盟（IUFoST）、國際谷物科技協(xié)會（ICC）、湖南省食品科學技術(shù)學會、洞庭實驗室、湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究所、中國食品雜志社、中國工程院Engineering編輯部、湖南大學、湖南農(nóng)業(yè)大學、中南林業(yè)科技大學、長沙理工大學、湘潭大學、湖南中醫(yī)藥大學協(xié)辦的“ 2025年中國工程院工程科技學術(shù)研討會—推進美麗鄉(xiāng)村建設(shè)-加快農(nóng)產(chǎn)品加工與儲運產(chǎn)業(yè)發(fā)展暨第十二屆食品科學國際年會”，將于2025年8月8-10日在中國 湖南 長沙召開。

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