在生物治療藥物界，單克隆抗體（mAb）堪稱 “扛把子”，幾乎占據了市場的半壁江山。這些 “糖蛋白大佬” 在誕生后，還會經歷一場名為 “翻譯后修飾” 的變裝秀，其中最引人注目的節目就是 N - 鏈糖基化。這場變裝秀可不簡單，直接影響著抗體的 “顏值”（結構）和 “戰斗力”（功能特性）。

糖基化這位 “神秘嘉賓”，自帶異質性屬性，它要是發揮不好，治療性糖蛋白的 “保質期”（穩定性）和 “藥效”（臨床療效）都得遭殃。也正因如此，它被業內人士奉為 mAb 產品的 “黃金標準”—— 關鍵質量屬性（CQA）。

咱們對中國倉鼠卵巢（CHO）細胞的糖基化 “生產線”，以及細胞培養液里那些 “化學小助手” 怎么影響最終產品的 N - 糖基化 “菜單”，已經有了不少研究成果。不過尷尬的是，這些成果大多是基于生產結束后，對最終累積糖基譜的 “考古式研究”。要是能知道 N - 糖基化在生產過程中的 “七十二變”，以及 mAb 糖型組成如何 “見招拆招”，實時應對生產變化，那可就能打造出超智能的集成過程模型，讓糖基化乖乖聽話，生產出更 “完美無瑕” 的產品啦！

帶著這個 “野心”，我們開啟了一場探索之旅，研究特定營養補料培養基添加物，比如半乳糖、錳這些 “神奇調料”，還有補料時間這個 “神秘鬧鐘”，究竟會怎么 “折騰” N - 糖基化途徑，從而調控赫賽汀生物仿制藥單克隆抗體 ——曲妥珠單抗的 N - 糖基化。為了掌握一手情報，我們搬出了 N-GLYcanyzer 過程分析技術（PAT）這個 “高科技偵探”，在實驗室規模的生物工藝里，以近乎實時的速度，緊盯補料分批和灌流模式下的糖基化 “嫌疑人”，就為了搞清楚單克隆抗體 N - 糖基化的 “時間魔法”，到底怎么被特定培養基添加物 “操控”。

這一研究，還真發現了不少 “內幕”！原來曲妥珠單抗的末端半乳糖基化，對培養基補料時間和細胞內的核苷酸糖池這兩個 “幕后大佬” 特別敏感。時間分析就像一部懸疑劇，在葡萄糖緊缺的補料分批培養 “片場”，單半乳糖和雙半乳糖 “主演” 的糖基化形式，產量隨著時間不斷 “加戲”。更有意思的是，不管是補料分批這種 “營養吃緊” 的模式，還是灌流這種 “營養管夠” 的模式，半乳糖基化的 “劇本” 居然有不少相似之處。

簡介

中國倉鼠卵巢（CHO）細胞堪稱 “頂流明星”！由它生產的單克隆抗體（mAb）穩坐市場 “頭把交椅”，不僅牢牢占據絕大部分江山，每年還保持著 “穩如老狗”的增長率。這邊廂，新藥像 “雨后春筍” 般不斷獲批上市；那邊廂，老款 mAb 專利一到期，生物仿制藥市場就開始 “瘋狂上分”。為啥 CHO 細胞這么 “牛”？因為它掌握著 “人源化變裝術”，能進行 N - 鏈糖基化這類超厲害的翻譯后修飾，妥妥的 mAb 生產 “理想型表達系統”。

說到 N 鏈糖基化，它就像給單克隆抗體做 “精致美容”，把特定寡糖（N - 糖）貼到抗體 Fc 區蛋白質骨架的天冬酰胺殘基上。可別小看這一貼，N - 糖會直接影響抗體的 “工作業績”，從穩定性到藥效學、藥代動力學，方方面面都得受它管。在哺乳動物細胞里，糖蛋白合成簡直是一場 “大型團戰”，內質網和高爾基體里的糖基化酶組成復雜網絡，相互配合。而且糖基化途徑還特別 “敏感”，細胞代謝一有風吹草動，分泌的單克隆抗體就會出現 “花式糖基化”。生物工藝里那些 “小調皮”，比如溶氧、pH 值、溫度和攪拌速率一變化，也會 “搗亂”，改變最終的糖譜。所以啊，在上游階段找出關鍵工藝參數和關鍵材料屬性，就像給藥物質量 “上保險”，畢竟它們直接決定了藥物的關鍵質量屬性，比如 N - 糖基化。

N - 糖鏈附著在 mAb 蛋白上，就像給抗體貼上了獨特 “標簽”，通過末端糖類就能區分，還直接影響藥物的臨床效果。有些 mAb 沒了巖藻糖基化，反而因禍得福，和 FcγRIII 受體 “貼貼” 更緊密，讓抗體依賴性細胞毒作用（ADCC）直線上升。末端半乳糖分支則像個 “小助推器”，增加與 C1q 結合活性，把補體依賴性細胞毒作用（CDC）拉滿。末端唾液酸是 “持久續航小能手”，能延長血清停留時間、調節抗炎活性。高甘露糖異構體就有點 “坑隊友” 了，容易和血清甘露糖結合凝集素 2 勾搭上，激活凝集素補體途徑，加速自身在體內的清除。正因為不同糖基化形式對 mAb 療效影響巨大，N - 鏈糖基化妥妥成了關鍵質量屬性，得全程 “重點盯防”。

科學家們為了調控單克隆抗體的糖基化譜，開啟了 “花式操作” 模式。他們發現，給 CHO 細胞的營養培養基里加點 “神奇調料”—— 能影響特定代謝途徑的補料添加物，就能改變 mAb 產品的糖基化譜。比如半乳糖、尿苷和錳，這些都是調節半乳糖基化的 “得力干將”。Gramer 團隊像 “美食家” 一樣，用不同劑量的尿苷、錳和半乳糖給細胞 “投喂”，發現 mAb 半乳糖基化速率跟著劑量 “水漲船高”，最后甚至 “吃到飽”。Kildegaard 團隊更 “狠”，只用 20mM半乳糖補料，就給 mAb 半乳糖基化帶來了 “統計學暴擊”。Sha 團隊則另辟蹊徑，用半乳糖補料替換葡萄糖，靠著細胞內 UDP - Gal 濃度上升，成功提升了半乳糖基化速率。不過，有些研究想靠增加末端半乳糖聚糖種類來提升唾液酸化，結果發現唾液酸轉移酶成了 “攔路虎”，根本行不通！

除了這些 “專業選手”，還有些不直接參與糖基化途徑的化學調節劑也來 “湊熱鬧”。丁酸鈉這位 “組蛋白去乙酰化酶抑制劑”，能讓細胞多產單克隆抗體，卻被發現細胞特異性生產率和糖基成熟度成反比，簡直是 “魚和熊掌不可兼得”。迷迭香酸最近也來 “試水”，雖然能提高單克隆抗體滴度，但對糖基化有沒有影響，目前還是個 “未解之謎”。

在補料分批和連續灌流工藝里，營養補料對 N - 糖基化的 “時間魔法” 一直是科學界的 “老大難” 問題。為啥搞不清楚？還不是因為缺了實時監測的 “神器”—— 集成過程分析技術（PAT）！不過別慌，我們帶著 N - GLYcanyzer PAT 系統閃亮登場啦！我們先用這個 “神器” 研究補料方案，以及半乳糖和錳補料對曲妥珠單抗在 CHO 細胞里的過程和 N - 糖基化譜的影響，在補料分批和灌流生物反應器里反復 “折騰”，就為了搞明白半乳糖利用率和各種營養物添加對單克隆抗體糖基化的影響。后續在灌流模式里，還用 N - GLYcanyzer 系統緊盯單克隆抗體 N - 糖基化譜的 “一舉一動”，看它對持續營養物補料有啥反應，誓要揭開 N - 糖基化時間影響的神秘面紗！

方案 1：補料分批培養和灌流培養研究概述。對于補料分批實驗，培養物每日（每24小時）或隔日（每48小時）補料，并添加葡萄糖（對照組）或葡萄糖和半乳糖（添加組）。對于添加組，在第一天補料時添加錳至1 μM。灌流實驗則使用基礎培養基或添加了半乳糖（1.8 g/L）和錳（1 μM）的基礎培養基進行灌流。我們將對單克隆抗體糖基化和半乳糖基化調控進行時間分析，以了解補料和補料方案的影響；數值將根據半乳糖基化指數 (GI) 和分離的糖型進行評估。

詳細實驗操作和結果，請參考原文。

灌流生物反應器培養

在一個 5L 的玻璃生物反應器里上演，這玩意兒堪稱細胞們的 “五星級酒店”，而它的 “智能管家” 就是賽多利斯家的 Biostat B-DCU 控制器，主打一個貼心服務。不過細胞們住得寬敞，實際使用面積也就 2L，相當于給它們劃分了專屬“豪華套間”。

在細胞們 “拎包入住” 前，咱可是做足了準備工作。把 “房間溫度” 精準控在 37°C，妥妥的人體舒適體溫，“室內 pH 值” 也穩定在 7.1，主打一個宜居環境。至于 “氧氣供應”，直接給拉到設定值 50%，這待遇，比人類住的地方還講究！要是 pH 值不聽話，要么給它 “吹點二氧化碳” 降降溫，要么用 0.5M 的 NaOH 快速 “中和一下脾氣”，總之必須讓環境時刻保持完美。

細胞大軍入場時，初始密度是 0.5×10? cells/mL，這相當于給反應器里來了一場 “細胞大遷徙”。為了讓細胞們住得舒服，還安排上了 Repligen 家的 “高端設備”—— 配備 0.2μm 中空纖維過濾器的 XCell ATF 2 不銹鋼裝置，開啟穩態灌流模式，這就好比給細胞社區裝上了一套超牛的 “水循環系統”。

從第 4 天到第 8 天，“換水速度”（置換速率）從每天 0.25 個容器體積，一路猛增到 1.0 個容器體積，這速度變化，細胞們估計都得感慨：“這是要帶我們體驗速度與激情啊！” 后面就一直保持 1VVD 的 “換水節奏”，直到收獲日，主打一個穩定輸出。而且流出速率還能根據濾液速率靈活調整，就像給細胞社區安排了個智能管家，保證整個培養期間 VVD 和活細胞密度穩穩當當，主打一個 “歲月靜好”。

每天都得給細胞們做 “體檢”，采集離線樣本分析各種培養參數，看看它們吃得好不好，住得舒不舒服。更絕的是，還用上了 N-GLYcanyzer PAT 系統，每天在線分析滴度和聚糖，這簡直就是給細胞們安排了 24 小時的 “私人醫生”，全方位監測健康狀況！這場細胞生存游戲，就問還有誰能比它們過得精致？

結果與討論

補料分批培養性能

本研究旨在探究添加半乳糖作為添加碳源如何隨時間推移影響單克隆抗體（mAb）的產量和N-鏈糖基化。我們研究了補料（葡萄糖或葡萄糖加半乳糖）的添加情況，并將補料時間調整為每日（24小時）或隔日（48小時），以了解其對CHO細胞培養以及單克隆抗體產量的影響。在首次補料時，向添加了半乳糖的培養物中添加1 μM錳，以進一步提高相對糖基化水平。

所有條件下的活細胞密度 (VCD) 影響所有培養物的峰值活力和壽命。每日補料的培養物的峰值密度高于僅隔日補料的培養物（圖 1A）。使用兩種補料策略的每日補料對照培養物的峰值 VCD 為 26.6 × 10^6 cells/mL，而隔日對照和添加培養物的峰值 VCD 分別為 22.8 × 10^6 cells/mL 和 24.3 × 10^ 6cells/mL。配對t 檢驗顯示，補料時間（每日與隔日）之間存在統計學意義，但對照組和添加組之間無統計學意義。基于這些結果，可以推斷，補料時間對峰值VCD 的影響比添加半乳糖作為次要碳源的影響更大。從培養壽命來看（圖 1B），所有細胞培養條件均能存活至第 10 天，細胞活力均高于 70%，一旦細胞活力降至此閾值以下，即可收獲。

圖 1. 補料分批培養工藝性能指標總結。活細胞密度（A）、活力（B）、氨含量（C）、乳酸含量（D）、葡萄糖含量（E）、葡萄糖消耗率（F）、半乳糖含量（G）和半乳糖消耗率（H）。

細胞在 “干飯” 這件事上，可太有自己的想法了！來看這場補料方案大比拼，不同補料策略下的氨生成趨勢，前期堪稱 “復制粘貼”，但到第 7 天就開始 “分道揚鑣”（見圖 1C）。每日補料的培養物，在第 4 天左右直接把氨濃度 “卷”到了峰值，對照組和添加組也不甘示弱，齊刷刷讓氨濃度飆到了約 2g/L，這波操作堪稱 “默契十足”。不過，熱鬧過后，氨濃度又乖乖回落到約 1g/L，至于兩組之間，愣是沒比出個高低，主打一個 “勢均力敵”。

再看隔日對照和添加組，氨濃度在第 4 天率先發力，分別沖到 2.23g/L 和 2.31g/L 的小高峰。誰能想到，接下來劇情大反轉，氨濃度先 “躺平” 到第 7天，又突然 “打雞血” 一路飆升，到第 10 天，隔日補料對照組直接把氨濃度拉到 5.31g/L 的 “天花板”，而隔日添加組稍遜一籌，峰值為 4.13g/L。這氨濃度一路高歌猛進，其實是細胞在瘋狂 “喊救命”—— 代謝壓力山大，氨基酸代謝尤其是丙氨酸代謝，早就亂成了一鍋粥！隔日補料培養的細胞外丙氨酸，好不容易在 3mM 達到人生巔峰，結果轉頭就開始 “走下坡路”。反觀每日補料培養，丙氨酸濃度跟開了掛似的，一路漲漲漲，到第 10 天，每日對照培養和添加丙氨酸的培養分別達到 5.5mM 和 4.1mM，簡直是 “沒有最高，只有更高”。要說為啥會這樣？可能每日補料培養的細胞掌握了 “獨家秘方”，把細胞內的氨和丙酮酸轉化成丙氨酸，妥妥的氨解毒 “小能手”！

再嘮嘮乳酸產量（見圖 1D），補料日之間的乳酸濃度變化，簡直像在跳 “同步舞”，第 5 天一起沖到峰值，隨后集體 “畫風突變”，開始消耗乳酸。每日對照和添加補料的乳酸產量，在第 5 天攜手拿下 3.5g/L 的 “高分”，之后就一路 “跌跌不休”。隔日補料培養物就比較 “含蓄” 了，第 5 天的乳酸峰值濃度只有 2.77g/L，之后更是 “佛系”，乳酸水平一路走低，到第 8 天就 “躺平”，一直維持在低位。要說乳酸產量為啥有這差異？還得怪葡萄糖補料速率！隔日補料培養物的葡萄糖補得不夠勤，導致葡萄糖水平比每日補料培養物低一大截，逼得細胞只能 “另辟蹊徑”，默默完成代謝轉換，簡直是 “生活所迫” 啊！

葡萄糖和半乳糖的補料分批消耗

為了搞清楚葡萄糖和半乳糖在 “吃貨細胞” 眼中誰更受歡迎，我們給培養物安排了嚴格的 “控糖計劃”—— 每天或隔天把葡萄糖含量精準卡在 5 g/L，妥妥的細胞界 “減肥食譜”。至于半乳糖這位 “新選手”，我們按照 3:10（半乳糖：葡萄糖，質量比）的比例 “投喂”，這個配方可是從海量文獻里 “抄作業” 得來的，堪稱學術界認證的 “黃金比例”。錳元素也來湊熱鬧，第一天就給培養物加了 1 μM 錳，這劑量同樣是 “抄文獻作業” 的成果。

翻開圖 1E，就像打開了細胞 “干飯日記”。上面那張記錄著隔日補料時細胞外葡萄糖濃度，下面那張則是每日補料的 “干飯數據”。在隔日補料組，第 4 天才迎來第一次 “加餐”，此時對照組葡萄糖濃度只剩 1.63 g/L，加了 “神秘配方” 的培養組稍微 “富裕” 點，還有 1.77 g/L。結果剛補完料，葡萄糖就被細胞們 “暴風吸入”，光速清零。第二次補料前，對照組葡萄糖濃度掉到 0.33 g/L，加了添加物的還有 0.92 g/L 存貨，這差距估計得 “歸功” 于半乳糖這個 “替補碳源”。再看葡萄糖消耗率，隔日補料組簡直是 “復制粘貼” 模式，沒啥明顯變化（圖 1F）。不過和每日補料組比起來，隔日組前 4 天明顯是 “餓壞了”，干飯速度更快。每日補料組在第 3 天開啟首次 “投喂”，這時對照組葡萄糖剩 3.5 g/L，加了半乳糖的組稍少點，有 3.3 g/L。雖然數據上有點小差異，看著像是半乳糖讓細胞對葡萄糖 “食欲減退”，但這點差距實在不夠看，說不定是后期乳酸 “亂入”，攪亂了干飯節奏。不過總的來說，結果和之前研究 “撞衫”，還挺合拍。

半乳糖在培養物里堪稱 “摸魚大師”，悄咪咪就積累起來了（圖 1G）。剛加進去的 24 小時，消耗速度快得像 “百米沖刺”，之后就開始 “躺平”，越來越慢（圖 1H），估計是一開始濃度 “爆表”，細胞們干飯都帶勁，后面吃撐了就懈怠了。兩種培養條件下，半乳糖消耗率都在 20 到 40 pg/cell/day 之間徘徊。更有意思的是，每日補料組的消耗率像 “慢性子”，慢慢悠悠達到穩定；隔日補料組則是補料時 “狼吞虎咽”，補料間隙就 “細嚼慢咽”。這些 “戲精”般的變化，又和之前研究對上了暗號 —— 半乳糖消耗率果然是 “劑量控”，濃度越高越能激發細胞的 “干飯魂”，直到 “吃飽” 為止。

補料分批培養生產力

研究了單克隆抗體滴度和生產率，以了解補料方案和添加物的影響。所有培養物均在第9天左右達到峰值滴度，隨后幾天反應器內的滴度下降（圖 2A）。這種損失可能是由于蛋白質降解造成的。每日補料培養物的峰值滴度分別為1.12 g/L（對照組）和1.23 g/L（添加物組）。隔日補料樣品的峰值滴度分別為1.11 g/L（對照組）和1.19 g/L（添加物組）。配對比較圖分析未顯示這些培養物在峰值滴度方面存在任何統計學意義。這可能是由于營養限制造成的，因為在所有培養物中，細胞外天冬酰胺在第 6 天就已耗盡，天冬酰胺是一種已知影響 CHO 細胞中mAb 生產的關鍵氨基酸。

圖 2. 補料分批培養的生產力、糖指數和糖前體。單抗滴度 (A)、單抗特異性生產力 (B)、相對累積半乳糖基化 (C)、相對累積甘露糖基化(D)。圖中展示了胞內 UDP-葡萄糖 (E) 和 UDP-半乳糖 (F) 核苷酸糖池，它們是單抗糖基化的前體。

來看看這場細胞界的 “生產效率大比拼”！在對比細胞特異性生產率（見圖 2B，此處應有聚光燈！）時，不同補料方案之間那可是暗藏玄機，上演著一出跌宕起伏的 “職場大戲”。

前 6 天，隔日補料培養的 “選手們”（對照組和添加組）堪稱 “卷王本王”，它們的平均細胞特異性 mAb 生產力一路 “狂飆”，把每日補料培養組遠遠甩在身后。不過有趣的是，對照組和添加組這兩位 “選手” 雖然表面上你追我趕，實際一查數據，根本就沒拉開差距！這就好比班級里兩個同學天天暗自較勁比成績，結果一考試總分一模一樣，也就是說，添加半乳糖和錳這倆 “輔助道具”，壓根沒給 mAb 生產率加 buff，那些細微的生產效率差別，全是補料時間在 “搞事情”。

再說說葡萄糖這位 “關鍵先生”，在隔日培養中，它的濃度被穩穩控制在 5g/L，就像一位盡職盡責的管家，把一切安排得明明白白，完全不用擔心葡萄糖耗盡會突然 “罷工”，打斷 mAb 的生產流水線。Fan 等人之前研究過葡萄糖饑餓對 mAb 生產力的影響，發現這倆簡直是 “死對頭”，葡萄糖越缺，mAb 生產力越不給力。不過神奇的是，輕微的 “挨餓” 對 mAb 生產力來說就是小 case，這和我們研究的結果簡直是 “英雄所見略同”，妥妥的 “科學界的默契擔當”！

補料分批單克隆抗體糖基指標

細胞里的糖類 “八卦” 可太精彩了！我們一頓操作猛如虎，根據觀察到的各路糖型的 “出場頻率”，算出了兩個超重要的 “糖類 KPI”—— 半乳糖基化指數（GI，見圖 2C，它就像半乳糖的個人業績表）和甘露糖基化指數（MI，見圖 2E，甘露糖的 “功勞簿”）。這些數值可是糖類們日日夜夜 “打卡” 累積的 “工作成果” 哦！

再來說說方案 2 里藏著的細胞 “糖類加工廠” 大揭秘！這工廠里，糖酵解、Leloir 途徑和糖基化組成了一個 “你中有我，我中有你” 的復雜朋友圈。葡萄糖就像個 “打工人”，一進細胞就一頭扎進糖酵解車間，吭哧吭哧工作，產出的能量一部分送去 TCA 循環 “發電站”，一部分支援蛋白質 “生產部”。半乳糖也不甘示弱，風風火火地進入細胞，通過 Leloir 途徑 “安檢口”，再順著葡萄糖 - 1 - 磷酸 (Glc - 1 - P) 這條 “傳送帶” 溜進糖酵解車間。不過這半乳糖可是個 “多面手”，一部分還偷偷跑去生產 UDP - 半乳糖 (UDP - Gal) ，這可是制作聚糖的 “原材料”，專門用來打造半乳糖基化的 mAb “豪華產品”。

方案底部還曝光了糖基化 mAb 的 “跨國旅行” 路線！它們從內質網 (ER) 出發，坐著 “細胞航班” 前往高爾基體。剛到高爾基體，就被 “化妝師” GlcNAc 拉去給殼二糖核心 “化妝”，接著還要經歷從 Man8 到最終 G0 或 G0F 的 “變形計”。等變完身，這些 “時髦精” 瞬時物種，要是碰上帶著錳 “魔法棒” 的半乳糖基轉移酶（比如 B4GALT），就會被 “點石成金”，加上半乳糖 “裝飾”，瞬間華麗升級！

方案2. 葡萄糖和半乳糖代謝的相互關聯。該圖簡要描述了葡萄糖轉運至糖酵解（上圖），以及半乳糖轉運至Leloir途徑（中圖），該途徑分支至糖酵解和糖基化途徑。圖下方描繪了mAb N-糖基化途徑，該途徑旨在產生更成熟的糖基形式，例如此處所示的G1F變體。

實驗一開始，在第一次加料前就取了樣，結果發現第三天時，兩種培養物里的 MAb 半乳糖基化竟然沒啥 “勝負之分”，跟約好了似的，一點統計學意義都沒有，這開局還挺平平無奇。

但接下來劇情開始反轉！加了半乳糖的培養物和對照組的 GI，那走勢簡直像失散多年的 “雙胞胎”，趨勢一模一樣。到第 10 天，每日補料對照組的 GI 是 23.7%，比隔日補料對照組的 34% 低了差不多 10%，這差距，仿佛隔日補料組偷偷開了 “小灶”！

再看加半乳糖又加錳的培養物，直接上演逆襲戲碼！和只加葡萄糖的對照組相比，它的半乳糖基化率 “蹭” 地一下就上去了，太猛了！每日補料的樣品 GI 是 55.5%，隔日補料的更夸張，直接飆到 69.1%，比每日補料多了 13.6%。看來在提高半乳糖基化這事上，隔日補料策略堪稱 “王者”，每日補料只能 “甘拜下風”。為啥加半乳糖這么好使？原來是它能通過 Leloir 途徑，讓 UDP-Gal 的生物合成瘋狂 “充值”，在培養前期，UDP-Gal 水平和相對 GI 就像 “最佳拍檔”，攜手共進。雖然隔日補料組的 mAb 生產力已經很優秀了，但 UDP-Gal 池和半乳糖基轉移酶活性這倆 “神助攻”，直接把 mAb 的半乳糖占據率又往上拉了一大截。這結果，和 Fan 等人研究葡萄糖饑餓的實驗簡直是 “英雄所見略同”，高和嚴重葡萄糖饑餓的培養物 GI，比低饑餓和非饑餓組高得多，妥妥的 “饑餓出奇跡”！

再瞧瞧甘露糖基化這邊，除了隔日補料對照組，其他培養物的相對累積甘露糖基化水平都 “乖巧” 得很，低于 3%。加了半乳糖和錳后，兩種補料方案的 MI 指數直接 “躺平” 下降，隔日補料對照組降到 2%，每日補料對照組更 “佛系”，只有 1.6%。沒加這倆 “神奇組合” 時，每日補料對照組 MI 是 2.5%，隔日補料對照組卻 “獨樹一幟”，達到 4.5%，差距顯著。這甘露糖基化增加的 “鍋”，得讓隔日對照組里積累的高濃度氨來背，它和 UDP-GlcNAc 池較低脫不了干系。

最后看看隔日補料對照組的 UDP - 葡萄糖（UDP-Glc）池，每次加料后，它的水平就像坐過山車一樣 “咻” 地沖上去，可到第 7 天后又 “唰” 地降下來，UDP-Gal 水平也跟著 “湊熱鬧”。看來這些核苷酸糖 “不安分”，不好好搞糖基化，跑去其他代謝途徑 “玩耍” 了，從對比隔日和每日補料對照組的核苷酸糖池和 MI 也能發現這點。都說培養基里葡萄糖濃度低，會讓聚糖成熟的 “原料”不夠，看來和 UDP-Glc 水平還真是 “難兄難弟”，關系密切得很呢！

補料分批培養中糖基化的時間變化

為了搞清楚補料分批培養這出大戲里糖基化是咋隨著時間 “整活” 的，我直接化身 “糖分精算師”！每天吭哧吭哧算相對糖異構體數量，這計算過程跟算自己每月零花錢花在哪了似的，全靠每日積累速率。算完這個還不夠，我又根據加權平均值的 “神秘走位”，算出了滴度，都給它畫到圖 3 里，方便圍觀這些數值的 “日常行為”。

不過我這計算可不是永無止境的，算到培養第 9 天就收手了，為啥？因為這天滴度達到 “人生巔峰”，后面就開始走下坡路，像極了熬夜追劇后第二天的精神狀態。還有那些唾液酸化物種，我干脆沒讓它們在報告里 “露臉”，為啥呢？因為它們每天的糖基化速率就跟佛系打工人似的，一點波瀾都沒有，毫無 “表演欲”。

再說說這些不同的糖型，好家伙，它們的變化趨勢簡直是 “復制粘貼” 了累積糖指數值的劇本。那些加了半乳糖和錳的培養物，里面的半乳糖基化物種就跟發現寶藏似的瘋狂增加，而 G0F-GlcNAc 和 G0F 這些 “非主流” 瞬時和截短物種，只能默默減少，仿佛在這場糖分競爭中敗下陣來，灰溜溜地退場。

圖3. 補料分批培養的相對每日糖型產量。此處顯示了主要的mAb糖型。唾液酸化糖型種類被省略，因為它們的產量幾乎沒有變化。

這些抗體糖型們在培養皿里的 “奇幻漂流”！先看截短的 G0F-GlcNAc 同工型（圖 3A），這小家伙堪稱 “佛系代表”，在各種環境里都穩穩把自己的 “存在感” 控制在 1% - 2%，簡直是 “躺平界楷模”。但遇到每日補料這一 “豪華套餐”，立馬支棱起來，存在感飆升到約 4%，看來也是個 “干飯積極分子”。

再看 G0 同工型（圖 3C），就像 “電量不足的手機”，隨著培養時間流逝，豐度持續走低。不過，隔日補料方案堪稱 “省電模式”，比每日補料更能讓它 “低調做人”，豐度降得那叫一個明顯。

要說 mAb 里的 “人氣王”，非 G0F 莫屬（圖 3D）。在每日補料對照方案下，它就像粉絲暴漲的 “網紅”，熱度蹭蹭往上漲；但在隔日對照里，后半段培養時間，它的每日相對豐度就開始 “走下坡路”，人氣大不如前。G0F 糖型在培養過程中總愛 “野蠻生長”，我們推測它在邁向半乳糖基化的路上，遇到了個 “攔路虎”—— 工藝瓶頸。不過別怕，半乳糖和錳這對 “黃金搭檔” 一出手，瓶頸立馬 “矮半截”。在每日添加培養里，G0F 糖型到第 5 天就 “躺平發育”，穩定分泌約 40%。可跟隔日添加培養比起來，它就像泄了氣的皮球，一路下跌，到第 9 天相對豐度直接跌破 20%。這說明在隔日補料的 “艱苦環境” 里，葡萄糖不夠用，半乳糖只能 “含淚轉行”，放棄能量代謝，一門心思投入到半乳糖基化 mAb 的生產大業中。隔日補料時添加半乳糖后 GI 的增加（圖 2C），就是它 “轉行成功” 的鐵證！

把目光轉向半乳糖 mAb 異構體，這里藏著半乳糖基化率的 “小秘密”。像 G1（圖 3E）、G1'（這位 “神秘嘉賓” 沒出鏡）、G2（圖 3F）這些 “小透明”異構體，因為豐度低，它們的細微變化就像 “躲貓貓高手”，很難被我們發現。但 G1F（G1 (α1-6) F）和 G1F'（G1 (α1-3) F）（圖 3G、H）就有意思了，它們和 G0F 異構體玩起了 “蹺蹺板游戲”，G0F 減少，G1F + G1F' 就增加，這說明半乳糖和錳這對 “CP” 一發力，抗體的半乳糖基化水平就直線上升。沒添加的培養物里，雙半乳糖聚糖異構體 G2F 產量雖然不高，但勝在穩定（圖 3I）。每日添加培養時，G2F 異構體開始 “逆襲”，后半段培養時間里，每天都穩定產出約 8 - 10% 的相對豐度。而在隔日添加補料方案下，G2F 直接開啟 “暴走模式”，到第 9 天產量逼近 20%。這下終于明白為啥隔日和每日添加樣品的 GI 不一樣了，原來是 G2F 糖型在 “暗中發力”！不過，唾液酸化卻對補料間隔 “無動于衷”，看來在唾液酸轉移酶活性這一塊，還藏著另一個 “頑固瓶頸”。好在錳和半乳糖這倆 “外援” 對唾液酸轉移酶沒影響，而且曲妥珠單抗本身就 “不愛” 唾液酸糖基形式。

最后再說說高甘露糖異構體 Man5（圖 3B），這簡直是個 “高冷選手”，半乳糖和錳的加入，在它眼里就跟 “過眼云煙” 似的，完全不影響它的每日相對豐度。對比每日和隔日補料方案對照，每日補料培養物里 Man5 的豐度和添加培養物差不多，都在 2% - 3% 之間徘徊。但隔日補料對照組的 Man5 從第 7 天開始 “突然發力”，到第 9 天直接 “沖上巔峰”，達到約 6.5%。這高甘露糖種類的增加，暗示糖基化代謝可能 “壓力山大”。大膽猜測一下，在隔日補料方案里，細胞外葡萄糖第 5 天就 “見底”，葡萄糖代謝只能 “先保命”—— 產生能量，顧不上 mAb 糖基化了。

灌流培養性能

為了搞清楚糖基化的 “神秘走位”，咱們開啟了灌流培養模式！和補料分批培養不同，這里的營養物質簡直是 “自助餐無限量供應”，主打一個敞開了吃！

兩種培養方式就像雙胞胎兄弟，開局很相似。對照組用的是 HIP-CHO 培養基，而“豪華加料組” 則是在 HIP-CHO 培養基（內含 6g/L 葡萄糖，這葡萄糖量，細胞看了都直呼 “管飽”）的基礎上，又大手一揮加了 1.8g/L 半乳糖和 1μM 錳。這葡萄糖和半乳糖的配比，那可是精準復刻了補料分批研究里進料的黃金比例！

一開始，兩種培養都按批次培養的老路子走，直到反應器里的葡萄糖濃度 “瘦身” 到 2g/L 及以下，重頭戲灌流模式才閃亮登場，給生物反應器里的細胞們瘋狂 “續糧”。

每天，咱都得化身 “手動調節大師”，對著濾液泵和廢棄泵一頓操作猛如虎，就為了讓兩種條件下的細胞密度穩定在約 20 x 10^6 cells/mL ，這密度，細胞們估計都得擠著喊 “別貼貼，貼貼危險又密不透風”！同時，還得按比例調節泵，保證整個穩態灌流過程都能維持 1 VVD，這就像是給細胞們安排了專屬的 “流量套餐”，不多不少，剛剛好。

最后，咱們把實驗結果和第 13 天的數據掰扯掰扯做對比。不過對照組的反應器屬于 “超長待機王”，一口氣運行了 20 天，堪稱培養界的 “馬拉松選手”！

圖4. 灌流培養工藝條件及指標。活細胞密度（A）、活力（B）、葡萄糖含量（C）、半乳糖含量（D）、氨含量（E）和乳酸含量（F）。

在工藝條件這場 “培養物生存大挑戰” 里，兩種條件下的培養物堪稱 “活力擔當”！瞅瞅圖 4B 就知道，它們在大部分 “運行時光” 里，活力值都穩如泰山，牢牢守住 90% 以上的 “生命線”，主打一個生命力頑強。

再把目光轉向葡萄糖水平，兩種條件下的培養物仿佛約好了似的，默契地把葡萄糖含量控制在 0.5 到 1g/L 這個 “舒適圈” 里（見圖 4C），就像精準的 “葡萄糖管理大師”。添加了 + Gal/Mn 的培養物在半乳糖這塊也有 “獨家操作”，從圖 4D 能看到，半乳糖水平穩定在 1 到 1.5g/L。這數據背后藏著個 “小秘密”—— 在細胞密度達到巔峰后的穩態灌流階段，每天大概有 0.3–0.8g/L 的半乳糖被 “悄悄消耗”，也不知道這些培養物是拿半乳糖當 “能量飲料”，還是搞什么 “神秘儀式”。

說到和對照組的 “battle”，添加 + Gal/Mn 的培養物在氨水平上直接 “碾壓”，比對照組低了約 0.5g/L（圖 4E），妥妥的 “氨含量卷王”。不過在乳酸水平上，它又畫風一轉，平均比對照組高（圖 4F），上演了一出 “高低起伏” 的戲碼。

當我們對比不同培養條件下的胞外氨基酸譜，好家伙，大部分氨基酸都跟 “復制粘貼” 似的，走勢相當一致。但 + Gal/Mn 培養物的天冬氨酸卻 “不走尋常路”，含量那叫一個高！這高含量天冬氨酸可不是 “花瓶”，它和更高的細胞生產力 “鎖死” 了，不過和細胞生長倒是沒啥 “親密關系”。這一系列結果，簡直就是 mAb 生產力提高的 “實力認證”！

灌流培養滴度和糖基化

平均而言，添加+Gal/Mn的生物反應器比對照組產物產量更高（圖 5A）。每種條件下都存在一些擾動，這可以通過手動更改廢棄泵和濾液泵來解釋，這些更改會影響細胞密度。然而，即使存在這些擾動，添加+Gal/Mn的反應器的產量仍然比對照組更高。在補料分批實驗中，已知使用半乳糖代替葡萄糖會導致生產收益遞減，因為半乳糖的轉運速度低于葡萄糖。Gramer等人的一項研究表明，使用半乳糖代替葡萄糖會導致生產收益遞減。研究了尿苷、錳和半乳糖在補料分批培養中的使用情況，發現少量添加這些補料添加物（即 0.9 g/L 半乳糖、2 μM MnCl 2和 1 mM 尿苷）會對產量產生積極影響，但隨著半乳糖、錳和尿苷濃度的增加，產量會略有下降。這可能也適用于灌流，這可能有助于了解為什么生產率高于對照培養。據我們所知，沒有文獻涉及添加半乳糖作為補料添加物來提高生產率。然而，已知用半乳糖部分替代葡萄糖會對生產率和最終產量產生不利影響。

圖5. 灌流培養的滴度、糖指數和糖前體。圖中顯示了每日反應器滴度 (A)、相對半乳糖基化指數 (B) 和甘露糖基化指數 (C)。圖中還顯示了核苷酸糖聚糖前體 UDP-半乳糖 (D) 和 UDP-葡萄糖 (E) 的細胞特異性濃度。

在圖 5B 里，GI 就像個 “低調的主角”，默默展示著自己的存在。咱們先瞧瞧對照培養物，它的半乳糖基化率簡直和 24 小時對照補料分批培養物是 “孿生兄弟”，相似度極高！到了第 10 天，對照培養物的相對半乳糖基化率 “慢悠悠”地爬到了 25% 左右，就像個不緊不慢散步的 “小蝸牛”。

再把目光轉向 + Gal/Mn 添加培養物，它可就 “干勁十足” 了！在培養期間，半乳糖基化率一路 “高歌猛進”，直接沖到了 54% - 56%，這成績和之前 24 小時添加補料分批培養實驗里的表現幾乎 “一模一樣”，妥妥的 “優秀生”！

接下來研究 UDP - Glc 水平（圖 5E），補料分批培養物這邊，對照培養物的 UDP - Glc 水平在培養結束時，就像泄了氣的皮球 —— 直線下降。灌流培養那邊呢，也有類似趨勢，不過對照灌流運行可聰明著呢！因為葡萄糖不斷 “送貨上門”，流入培養基，所以它的 UDP - Glc 池永遠不會 “彈盡糧絕”。+Gal/Mn灌流培養的細胞內 UDP - Glc 水平更是 “穩如泰山”，始終保持恒定。說起來可有意思了，第 10 天之后，對照組的 UDP - Glc 水平 “一路滑坡”，而 + Gal/Mn 灌流培養的 UDP - Glc 水平卻牢牢 “守住陣地”，穩穩保持在 0.4 至 0.6 fmol/cell 之間，估計是 UDP - Gal 在偷偷 “搞事情”，轉化成 UDP - Glc 了！

再來對比灌流培養之間的 UDP - Gal 水平（圖 5D），只要在補料里加點半乳糖和錳，UDP - Gal 水平就像被按了 “上升鍵”，蹭蹭往上漲，這效果太顯著了！+Gal/Mn 里這么高的 UDP - Gal 水平，也難怪半乳糖基化率會 “一路飆升”。不過有趣的是，半乳糖基化的最高水平好像就到 55%，和葡萄糖缺乏的補料分批隔日補料下 70% 的更高累積率相比，還是差了點。之前也提到過，灌流反應器采用連續補料的方式，半乳糖基化率反而比每日或隔日補料的要低，這就像一道神秘的 “謎題”。看來得安排更多研究，好好 “審問” 一下葡萄糖饑餓對半乳糖基化的影響，說不定能找到讓半乳糖基化率 “瘋狂上漲” 的 “隱藏秘籍”呢！

最后看看 MI（圖 5C），甘露糖基化在對照培養物里 “躺平”，穩定在 2% 左右，在 + Gal/Mn 培養物里也差不多，穩定在 1.5% 左右。這結果和咱們在補料分批每日補料對照培養物、添加 Gal/Mn 的培養物里得到的幾乎 “如出一轍”，細胞們在這方面還挺 “念舊”，保持著一貫的 “風格”！

結論

此次研究聚焦于 CHO 細胞培養進程中，單克隆抗體糖基化模式隨時間的動態變化，同時通過觀察添加半乳糖和錳后關鍵代謝物的變動，深入剖析其內在機制。研究采用兩種實驗模式：其一為補料分批生物工藝，按比例添加半乳糖與葡萄糖，并于首日添加錳（添加頻率分為每日添加或隔日添加），以此探究葡萄糖限制這一次要變量的作用；其二為灌流操作（無營養限制），將半乳糖和錳加入培養基，保持培養物處于穩定狀態。

在補料分批培養研究中，結果顯示，對峰值細胞密度影響顯著且積極的因素是補料時間表，而非半乳糖的添加。與其他補料策略相比，每日補料方案使峰值乳酸產量提升了 0.7 g/L。不過，隔日補料在培養后期會產生更高的氨產量，原因在于每日補料培養物能更有效地將氨代謝為丙氨酸。半乳糖補料和補料時間對葡萄糖消耗率影響較小，這或許與乳酸的共同消耗有關。研究證實，半乳糖消耗率會隨胞外半乳糖濃度升高而增加，這與既往研究結論相符。雖然半乳糖和補料方案對峰值滴度無影響，但隔日補料培養物在前半段培養期的平均產量更高。除培養性能存在差異外，補料方案對 mAb 糖基化的影響最為突出。添加半乳糖和錳顯著提升了半乳糖基化速率，其中隔日補料培養物的半乳糖基化率高達 70%，而每日補料培養物僅為 50%。與對照組相比，添加半乳糖和錳后，所有實驗組的甘露糖基化率均有所下降。

灌流研究表明，添加半乳糖和錳能夠提高對照培養物的滴度，半乳糖基化水平也顯著提升。添加半乳糖和錳的培養物，其相對半乳糖基化水平達到 55%，而對照培養物則降至約 25%。添加半乳糖可恢復 UDP - 葡萄糖池，而對照培養物中的 UDP - 葡萄糖在培養過程中會逐漸耗盡。該研究進一步揭示了糖基化網絡以及聚糖前體對 CHO 細胞代謝及其 N - 糖基化途徑的影響。

綜上，本研究初步明確了半乳糖和錳對 mAb 產品質量的影響機制。后續研究將著重深化相關理解，并運用過程分析技術（PAT），構建基于精準糖基前體劑量的工藝控制方案，推動上游生物工藝實現均質糖基化。

原文：A. Gyorgypal, E. Fratz-Berilla, C. Kohnhorst, et al., Temporal Galactose-Manganese Feeding in Fed-Batch and Perfusion Bioreactors Modulates UDP-Galactose Pools for Enhanced mAb Glycosylation Homogeneity. Biotechnology and Bioengineering, 2025.

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