摘要：抗體藥物偶聯物（ ADC ）是通過將細胞毒性藥物或 “ 有效載荷 ” 與單克隆抗體偶聯來合成的。有效載荷使用氨基或巰基特異性接頭偶聯，這些接頭與抗體表面的賴氨酸或半胱氨酸反應。典型的抗體包含超過 60 個賴氨酸和多達 12 個半胱氨酸作為潛在的偶聯位點。所需的 DAR （藥物 / 抗體比率）取決于許多不同的因素，范圍從 2 到 8 種藥物 / 抗體不等。潛在偶聯位點的數量與所需 DAR 之間的差異，再加上使用非位點特異性的常規偶聯方法，導致 ADC 的 DAR 和偶聯位點都不同。異質 ADC 包含大量具有次優 DAR 的組分，已知這些組分具有不需要的藥理學特性。因此，已經開發了合成均相 ADC 的新方法，以增加它們作為治療劑的潛力。本文將回顧最近報道的制備具有更高同質性的 ADC 的工藝。討論了每種工藝的優勢和潛在局限性，重點介紹了相對于類似異質 ADC 的效率、質量和體內功效。

1.介紹

抗體藥物偶聯物（ADC）是一類快速增長的癌癥靶向治療劑。盡管自2005年以來臨床試驗中的ADC數量穩步增加，但許多ADC未能進入臨床開發的后期階段;一種已退出市場（2002年的Mylotarg），目前只有兩種（Adcetris和Kadcyla）被FDA批準用于癌癥適應癥（圖1A）。因此，到目前為止，ADC的批準率尚未達到早期預期，落后于其他基于抗體的療法。根據已批準的ADC與未能進入后期臨床試驗的ADC的數量，成功率讓人想起小分子藥物的成功率。ADC臨床失敗的原因通常未知或仍在調查中。更常見的是，當臨床失敗的原因很明確時，信息不會向公共領域提供。新出現的臨床前數據表明，異質性是目前大多數臨床開發中的ADC共有的特性（表1），最終可能會限制它們作為治療劑的潛力。

表1.目前用于癌癥適應癥臨床試驗的異質性ADC示例

圖1.（A）2006年至2014年處于臨床開發不同階段的ADC數量。（B）典型IgG抗體的結構，顯示賴氨酸（紅色）、半胱氨酸（黃色）和聚糖（綠色）是潛在的偶聯位點。

ADC由細胞毒性藥物或與腫瘤選擇性單克隆抗體偶聯的“有效載荷”組成。傳統ADC的異質性源于目前用于偶聯的合成過程。有效載荷通常使用氨基或巰基特異性接頭與抗體偶聯，這些接頭與抗體表面的賴氨酸或半胱氨酸反應。典型的抗體包含超過50個賴氨酸和多達12個半胱氨酸作為潛在的偶聯位點（圖1B）。然而，大多數ADC的最佳DAR（藥物/抗體比）范圍為2至8種藥物/抗體，并且取決于各種不同的因素。潛在偶聯位點數量與所需DAR之間的差異，再加上使用非位點特異性的偶聯方法，導致ADC的DAR和偶聯位點都不同。因此，傳統的異質性ADC通常包含大量未偶聯的抗體以及DAR不理想的組分。未偶聯的抗體可以競爭抗原結合并抑制ADC活性，而DAR不理想的組分通常容易聚集、溶解度差和/或不穩定性，最終導致治療窗不佳。

ADC異質性的相對程度取決于用于偶聯的方法。例如，Kadcyla是2013年批準用于乳腺癌的ADC，它是使用兩步過程合成的，其中接頭和有效載荷在不同的步驟中偶聯（方案1A）。接頭包含氨基特異性NHS酯，第一步與抗體賴氨酸反應，第二步包含巰基特異性馬來酰亞胺基團，與美登素有效載荷反應。該工藝提供了高度異質的ADC分子混合物，含有0至10個有效載荷/抗體，平均DAR為3.5個藥物/抗體。由于有效載荷分布在數十個潛在的偶聯位點上，因此會出現額外的異質性。因此，Kadcyla包含數百種不同的ADC分子，每種分子都有自己獨特的藥理學特性。

方案1.（A）通過賴氨酸偶聯合成ADC（如Kadcyla）的一般過程;（B）通過半胱氨酸偶聯合成ADC（如Adcetris）的一般過程

與賴氨酸偶聯相比，通過鏈間半胱氨酸將有效載荷與抗體偶聯降低了ADC異質性，因為潛在的偶聯位點較少。Adcetris是2011年獲批用于治療霍奇金淋巴瘤的ADC，是半胱氨酸偶聯ADC的一個例子。半胱氨酸偶聯過程涉及4個抗體鏈間二硫鍵的部分還原，以生成多達8個反應性巰基。隨后，部分還原的抗體與含有巰基特異性馬來酰亞胺接頭的有效載荷偶聯。用于Adcetris的有效載荷是單甲基auristatinE（MMAE），并包含蛋白酶可切割的馬來酰亞胺接頭（方案1B）。盡管Adcetris的異質性低于Kadcyla，但它由數十種不同的ADC分子組成，包含0到8個有效載荷，平均DAR為3.6個藥物/抗體。與大多數半胱氨酸偶聯的ADC一樣，與母體抗體cAC10相比，Adcetris在體內的半衰期更短。半衰期縮短歸因于高DAR物質（>4藥物/抗體）的快速清除和偶聯過程中鏈間二硫鍵的部分丟失。

盡管合成Adcetris和Kadcyla采用不同的賴氨酸和半胱氨酸偶聯過程，但這兩種ADC在有效載荷和抗體之間都包含硫代琥珀酰亞胺鍵，這源于在偶聯過程中使用馬來酰亞胺接頭。Kadcyla在接頭和有效載荷之間包含一個硫代琥珀酰亞胺（方案1A），而Adcetris在接頭和抗體之間包含一個硫代琥珀酰亞胺鍵（方案1B）。已知硫代琥珀酰亞胺基團會發生不需要的副反應，例如消除或硫醇交換，這可能導致ADC有效載荷過早釋放，并導致效力降低和/或全身毒性增加。

盡管傳統異質ADC存在已知局限性，但目前臨床開發的大多數ADC都使用與方案1中描述的類似的偶聯方法。因此，它們可能具有與Adcetris和Kadcyla相似的藥理學特性，此外還有其他在臨床試驗中表現不佳的不太成功的ADC。為了改善當前和未來ADC的藥理學特性，目前正在開發用于合成均相ADC的新型位點特異性偶聯工藝。

用于構建均相ADC的位點特異性偶聯工藝可分為三個不同的類別。其中兩項側重于抗體修飾（工程氨基酸和酶介導），而第三類側重于接頭修飾。這些類別可以根據使用的特定過程進一步細分（表2）。根據足夠的臨床前數據可用性選擇每個過程的示例，以便與類似的常規異質ADC進行比較。從這些過程中衍生的同質ADC才剛剛開始進入臨床試驗。它們是否會在臨床試驗中優于異質性ADC仍不確定，但臨床前數據表明，均相ADC可能會在未來的臨床試驗中占據主導地位，并將帶來更好的臨床結果。

表2.構建同構ADC的不同工藝總結

工程氨基酸方法

構建同質ADC的早期嘗試是通過還原鏈間二硫鍵，然后將有效載荷與所有八個鏈間半胱氨酸共軛來進行的。該過程導致四個鏈間二硫鍵丟失，并且由于當時可用的有效載荷的疏水性，經常導致ADC聚集、不穩定和/或溶解度差。這些含有8種藥物/抗體的滿載ADC也表現出較差的藥代動力學特性，與具有較低DAR的類似異質ADC相比沒有顯著優勢。目前用于制備常規異質ADC（如Adcetris或Kadcyla）的偶聯方法是為了克服與滿載ADC相關的潛在缺陷而開發的。異質性被認為是對降低DAR所獲得的好處的可接受懲罰。現在很明顯，合成均相ADC的新方法是ADC充分發揮其治療潛力的必要條件。

大多數合成均相ADC的新方法都需要重組工程，以便將獨特的官能團引入抗體中以進行位點特異性偶聯。在位點特異性偶聯的早期例子中，Rader及其同事將硒代半胱氨酸摻入抗體中，以獲得每個抗體含有一種或兩種藥物的ADC。最近，幾種不同的工程化氨基酸方法已成功用于生成每種抗體2種、4種或8種藥物的均相ADC。在大多數情況下，工程化ADC在體外和體內的表現優于類似的異質ADC，但在臨床開發之前應考慮潛在的局限性。例如，用于抗體再造的重組方法不適用于現有的“現成”抗體，這在某些情況下可能是可取的。重組方法的其他潛在挑戰包括確定最佳偶聯位點、可能的免疫原性以及使用尚未經過臨床驗證的抗體表達系統。目前尚不清楚ADC均一性的好處是否會超過與開發這些方法相關的額外時間和成本，但在生產具有改進藥理學特性的均相ADC方面已經取得了重大進展。

工程半胱氨酸

使用重組抗體工程來提高ADC均一性的第一個示例涉及兩種相反的策略，即去除或添加半胱氨酸殘基。Carter及其同事通過用cAC10（Adcetris中使用的抗CD30抗體）中的絲氨酸替換來系統地去除鏈間半胱氨酸。然后將剩余的半胱氨酸與眾所周知的auristatin有效載荷（MC-vc-Pab-MMAE）偶聯，以產生含有兩種或四種藥物/抗體的均相ADC（方案2A）。發現所得ADC具有與類似異質ADC相當的藥理學特性。這使作者得出結論，改善同質性對ADC的治療指數影響最小;然而，工程化ADC中鏈間二硫化物的損失可能掩蓋了同質性改善帶來的潛在收益。

方案2.面向同質ADC的工程半胱氨酸方法

方案a（A）用絲氨酸取代4個鉸鏈鏈間半胱氨酸，然后用常規馬來酰亞胺接頭還原和偶聯，得到具有4種藥物/抗體的均相ADC;（B）半胱氨酸點突變被引入抗體的重鏈和/或輕鏈中。工程半胱氨酸以氧化態表達。鏈間二硫化物的輕度還原和再氧化產生還原形式的未配對半胱氨酸，適合與傳統的馬來酰亞胺接頭偶聯，以獲得具有2或4種藥物/抗體的均相ADC。（C）半胱氨酸被引入H或L鏈的N末端，并與醛接頭偶聯，與抗體形成穩定的噻唑烷鍵。

Junutula及其同事的另一種方法導致了不同的結論。半胱氨酸突變被引入抗MUC16抗體3A5重鏈的第114位。突變提供了兩個獨特的不成對的巰基，適合與含有常規馬來酰亞胺接頭的有效載荷偶聯。該工藝提供了主要包含兩種藥物/抗體的ADC，但是，需要額外的還原和氧化步驟才能獲得適合偶聯形式的突變抗體（方案2B）。硫代單克隆抗體ADC（又名TDC）顯示出與傳統異質ADC相當的療效，但TDC的相對毒性顯著降低，從而提高了治療指數。在隨后的研究中，Boswell及其同事使用類似的方法來構建抗STEAP1ADC，并獲得了相當的結果。

工程化半胱氨酸方法后來通過工程化曲妥珠單抗與美坦新有效載荷（DM1）的位點特異性偶聯應用于替代有效載荷。DM1有效載荷類似于Kadcyla中使用的有效載荷，Kadcyla是一種異質性曲妥珠單抗ADC，于2013年被批準用于治療Her2陽性乳腺癌。將所得均相TDC的藥理學特性與Kadcyla進行比較，TDC在大鼠和細胞毒性研究中均顯示出更高的安全性。有趣的是，TDC的藥代動力學特征與Kadcyla基準相當。這使研究人員得出結論，安全性的改善可能是由于去除了Kadcyla中存在的高DAR物質，而不是提高了接頭穩定性。

Pillow及其同事的一項后續研究利用肟連接子通過重鏈和輕鏈上的工程半胱氨酸將DM1與曲妥珠單抗偶聯，以生成具有四種藥物/抗體的均相TDC。觀察到TDC與Kadcyla相比，療效和安全性進一步改善。改善的性能歸因于肟連接子穩定性的增強，然而，其他因素，例如通過不同側鏈（Lys與Cys）在抗體的不同位置偶聯的不同接頭（SMCCvsMPEO或MPA）可能導致觀察到的藥理學特性差異。因此，無法從這些研究中確定均一性或接頭穩定性對觀察到的治療指數改善的相對貢獻。總之，工程半胱氨酸方法為均相TDC提供了優于傳統ADC的治療窗口。這些改進主要歸因于接頭穩定性的提高和異質ADC中存在的高DAR物質的消除。

也有報道稱，通過非馬來酰亞胺接頭偶聯的工程半胱氨酸。例如，Casi及其同事在抗體重鏈和輕鏈的N末端引入了半胱氨酸殘基，以實現與醛的位點特異性偶聯。工程抗體與cemadotin醛衍生物偶聯。偶聯過程導致在有效載荷和抗體之間有效形成可切割的噻唑烷鍵，旨在在體外緩慢釋放有效載荷（方案2C）。ADC每個抗體含有4個有效載荷，在體外對表達抗原的細胞表現出中等效力，但未報道其體內療效。

從合成均相ADC的工程半胱氨酸方法中吸取的一個重要教訓是，發現偶聯位點的位置會對ADC活性產生巨大影響。Shen及其同事將半胱氨酸突變引入曲妥珠單抗重鏈和輕鏈上的三個不同位點。所得硫瘤單抗用于通過與auristatin有效載荷（MC-VC-MMAE）偶聯構建均相ADC，該有效載荷含有類似于Adcetris中使用的可切割、自解脫的二肽馬來酰亞胺接頭。根據溶劑可及性和局部電荷的差異選擇三個偶聯位點（LC-V205C、HC-A114C和Fc-S396C）。所有三種硫代曲妥珠單抗-MC-VC-MMAEADC都表現出相當的均一性，DAR范圍為1.7-1.9藥物/抗體，并且僅在其偶聯位點上有所不同。值得注意的是，ADC在體內表現出截然不同的藥理學特性，這主要歸因于接頭穩定性的差異。

ADC的天然LC/MS分析表明，接頭穩定性與馬來酰亞胺水解為開環形式的速率相關，該形式不易過早釋放有效載荷。假設觀察到的水解速率差異是由于不同偶聯位點的微環境的細微變化造成的。這一假設后來被Tumey及其同事證實，他們使用馬來酰亞胺接頭合成了異質曲妥珠單抗ADC。隨后在體外將ADC水解為開環亞型，并將其藥理學特性與含有常規（閉環）馬來酰亞胺接頭的類似ADC進行比較。正如預期的那樣，與傳統（閉環）ADC相比，包含開環形式的ADC表現出更高的穩定性和卓越的功效。總體而言，結果表明偶聯位點可以顯著影響ADC活性，這表明每個ADC的最佳偶聯位點可能不同。

通過使用工程半胱氨酸，ADC技術取得了幾項重要突破。例如，Seattle Genetics的研究人員最近報道了SGN-CD33A，這是一種ADC，含有高效的吡咯并苯二氮卓類二聚體（PBD）有效載荷，其效力是當前微管蛋白抑制劑有效載荷（如MMAE或DM1）的10-100倍。由于PBD的水溶性差，早期使用PBD有效載荷構建常規ADC的嘗試通常會導致聚集體形成。通過工程半胱氨酸偶聯能夠合成每個抗體僅包含兩個PBD的均相ADC，并將聚集降低到可接受的水平。此外，在具有多藥耐藥表型的AML腫瘤模型中，所得的ADC比眾所周知的抗CD33ADC（Mylotarg）具有更好的效力。對于含有類似PBD有效載荷的抗CD70ADC，也報告了陽性結果，該有效載荷通過重鏈上239位的工程半胱氨酸偶聯。工程化半胱氨酸方法將這兩種均相ADC推向了早期臨床開發，初步結果非常令人鼓舞。

工程非天然氨基酸

非天然氨基酸（nnAAs）已被用作半胱氨酸的替代品，以提供位點特異性偶聯位點。與工程半胱氨酸相比，nnAA方法具有多項優勢，因為不同側鏈的多樣性可以作為潛在的偶聯位點引入。例如，可以消除與工程半胱氨酸和馬來酰亞胺接頭相關的責任，并且可以測試可能與常規半胱氨酸偶聯方法不兼容的新有效載荷。此外，在抗體重鏈和輕鏈上摻入具有不同側鏈的nnAA將使具有不同作用機制的有效載荷與同一抗體偶聯。

最近報道了許多不同的過程，其中非天然氨基酸被用于獲得具有改進特性的ADC。例如，終止密碼子抑制技術（EuCODE）用于表達在重鏈上115位含有對乙酰苯丙氨酸（pAF）的抗體。pAF側鏈與含有烷氧基胺接頭的auristatin有效載荷（MMAD）的位點特異性偶聯與抗體形成穩定的肟鍵。偶聯過程提供2種藥物/抗體的ADC（方案3A）。將所得的非天然氨基酸藥物偶聯物（NDC）與在重鏈上相同位置含有工程半胱氨酸而不是pAF的類似硫瘤藥物偶聯物（TDC）進行了比較。TDC有效載荷包含一個與NDC類似的肟連接子，但添加了一個馬來酰亞胺基團以實現與半胱氨酸的偶聯。因此，NDC和TDC之間的活性差異可歸因于存在（或不存在）與抗體的硫代琥珀酰亞胺連接。結果表明，均相NDC在體內的表現優于TDC，部分原因是NDC中不存在硫代琥珀酰亞胺基團。

方案3.通過工程非天然氨基酸合成均相ADC

方案a（A）對乙酰苯丙氨酸（pAF）在H鏈上取代Ser115。pAF與烷氧基氨基接頭的偶聯形成穩定的肟鍵，并產生具有2種藥物/抗體的NDC。（B）對疊氮甲基苯丙氨酸（pAMF）在重鏈上取代Ser136。通過菌株促進的疊氮化物-炔烴環加成反應（SPAAC）將pAMF與炔烴接頭偶聯，使NDC具有2種藥物/抗體;（C）將疊氮基賴氨酸類似物摻入抗體重鏈或輕鏈中，然后與炔烴接頭進行位點特異性偶聯，與抗體形成穩定的三唑鍵。

工程化非天然氨基酸為接頭化學提供了傳統偶聯方法或工程半胱氨酸無法實現的新選擇。例如，Zimmerman及其同事將非天然氨基酸與無細胞表達系統結合使用，將對疊氮甲基l-苯丙氨酸（pAMF）摻入曲妥珠單抗的數十個不同位點。pAMF氨基酸被設計為通過應變促進的疊氮化物-炔烴環加成銅自由點擊化學與炔烴接頭偶聯（方案3B）。結果與以前的方法一致，因為ADC活性高度依賴于偶聯位點。抗體表達和偶聯效率也受pAMF位置的影響，表明每種抗體的最佳偶聯位點可能不同。數據支持這一建議，因為根據抗體表達和偶聯效率，發現以前用于制備NDC和TDC的HC-Ala114偶聯位點不如Ser136。需要進一步的研究來確定偶聯位點在應用于不同的抗體時是否保持最佳狀態。

替代DNA靶向有效載荷，如吡咯并苯二氮卓二聚體（PBD），已通過非天然氨基酸成功與抗體偶聯，從而使用兩種藥物/抗體產生均一的NDC。例如，VanBrunt及其同事使用基于細胞的哺乳動物表達系統以高產量（1.7g/L）生產Her2特異性抗體（4D5）的變體。這些變體包含用末端疊氮化物基團修飾的非天然賴氨酸類似物（N6-2-疊氮氧基羰基-l-賴氨酸）。疊氮基賴氨酸衍生物被設計到抗體的任一鏈（HC-274或LC-70）上的位置，以便通過銅輔助炔烴環加成（CuAAC）點擊化學（方案3C）實現位點特異性偶聯。在室溫下4小時后，以高效（>95%轉化率）偶聯含有炔烴接頭的AuristatinF或PBD有效載荷，以獲得具有1.9種藥物/抗體的NDC。偶聯過程與抗體形成穩定的三唑鍵。通過大鼠單次靜脈注射在體內測定NDC穩定性，發現與未結合的曲妥珠單抗相當。此外，PBDNDC在Her2陽性BT474荷瘤小鼠中以1mg/kg的劑量每周給藥后，顯示出優于類似auristatinNDC的療效。這一結果進一步驗證了PBD作為傳統微管蛋白抑制劑替代品的使用。

酶介導的方法

轉谷氨酰胺酶

已經報道了位點特異性偶聯的替代方法，其中使用酶對具有獨特官能團的抗體進行位點特異性修飾以進行偶聯。例如，Strop及其同事將微生物轉谷氨酰胺酶（mTG）識別序列標簽（LLQGA）引入抗EGFR抗體的90個不同位置。谷氨酰胺標簽作為酰基供體，用于酶促連接mTG催化的伯胺（方案4A）。標記抗體與含有可裂解（Ac-Lys-vc-MMAD）或不可裂解（amino-PEG6-MMAD）伯胺接頭的MMAD有效載荷酶促偶聯。根據偶聯效率，12個位點被認為足以進行ADC合成，并選擇了兩個位點（重鏈和輕鏈各一個）進行進一步評估。谷氨酰胺標簽被設計成不同的抗體，并始終如一地為具有DAR的ADC提供>1.8藥物/抗體，通過非變性MS分析確定。使用轉谷氨酰胺酶從可切割的Ac-Lys-VCP-MMAD有效載荷制備ADC，并在體內評估其藥理特性。

方案4.合成均相ADC的酶介導方法

方案a（A）將谷氨酰胺標簽（LLQGA）插入抗體中，用于轉谷氨酰胺酶介導的與含有伯氨基的有效載荷偶聯。mTG將氨基轉移到谷氨酰胺標簽上，與抗體形成穩定的酰胺鍵。（B）將識別序列（CXPXR）插入抗體重鏈中。用甲酰甘氨酸生成酶（FGE）處理可將半胱氨酸標簽轉化為甲酰甘氨酸，從而能夠與肼接頭進行位點特異性偶聯。（C）SortaseA介導的合成;識別序列（LPETG）被引入重鏈和/或輕鏈的C末端。使用SortaseA與含有五甘氨酸接頭的有效載荷偶聯，與抗體形成穩定的酰胺鍵。（D）通過糖工程進行的位點特異性偶聯。唾液酸基團被引入重鏈的Asn297上，并用高碘酸鹽氧化成醛。醛與烷氧基氨基接頭的偶聯與抗體形成穩定的肟鍵。（E）天然聚糖的內切糖苷酶修剪暴露了Asn297上的兩個GlcNAc基團，然后將其連接到用疊氮化物基團修飾的GalNAc衍生物上。然后通過點擊化學將疊氮化物與含有炔基（BCN）的有效載荷偶聯。

一般來說，mTG修飾的ADC與通過常規方法合成的對照ADC具有相當的功效。此外，它們在嚙齒動物中表現出更高的穩定性和更低的毒性，部分歸因于與抗體形成穩定的酰胺鍵。據報道，含有不可切割接頭的有效載荷也具有很高的偶聯效率，但未報告其效力。不可切割的ADC可能是信息對照，因為藥物釋放可能僅限于抗體降解。相反，本研究中使用的對照ADC是異質的，具有更高的DAR，并且包含與不同位點偶聯的有效載荷。因此，mTG介導的偶聯產生的酰胺鍵的相對影響仍然不確定。

或者，可以使用轉谷氨酰胺酶而不引入序列標簽。早期研究表明，抗體在N297位點的去糖基化能夠使位點特異性細菌轉谷氨酰胺酶（BTG）介導的與Q295位點的天然谷氨酰胺偶聯。Lhospice及其同事后來產生了具有N297Q突變的cAC10（Adcetris中的抗CD30抗體）的無糖基化變體。該突變使MMAE有效載荷能夠使用BTG與重鏈上的Q295和Q297進行位點特異性偶聯。偶聯過程提供了含有4個有效載荷/抗體的ADC，效率為70%，但存在大量較低的DAR。盡管如此，轉谷氨酰胺酶修飾的ADC的藥理學特性與Adcetris相當。總體而言，研究結果將轉谷氨酰胺酶方法擴展到包括具有4種藥物/抗體的ADC，并表明可以使用無糖基化抗體而不會產生不良反應。

甲酰甘氨酸生成酶（FGE）

替代酶介導的方法已被用于構建均相ADC。Drake及其同事將甲酰甘氨酸生成酶（FGE）的識別序列（CXPXR）引入通用IgG1抗體的八個不同位點（1個輕鏈位點和7個重鏈位點）。該方法讓人想起工程化的半胱氨酸方法，不同之處在于半胱氨酸是作為五肽插入而不是單點突變引入的。用FGE處理突變抗體導致半胱氨酸位點特異性轉化為甲酰甘氨酸。由于結構限制，相對于其他重組方法，插入的肽減少了潛在偶聯位點的數量，但醛官能團使新的偶聯化學反應成為可能。兩個重鏈標記位點導致高度聚集的抗體，一個被預測為具有免疫原性。選擇其余5個位點中的3個使用曲妥珠單抗作為基準抗體進行評估。醛標記抗體通過HIPS化學與含有適當修飾的肼接頭的美登新載荷進行位點特異性偶聯（方案4B）。

將所得均相ADC的藥理學特性與Kadcyla進行了比較，Kadcyla是一種具有類似美坦新有效載荷的異質曲妥珠單抗ADC。與以前的方法一致，與Kadcyla相比，均相曲妥珠單抗ADC在體內表現出相當的效力、更高的穩定性和更低的毒性。與以前方法的結果相反，偶聯位點沒有顯著影響ADC療效，并且在異種移植腫瘤模型中觀察到腫瘤生長抑制的差異最小。Kadcyla和FGE標記的ADC之間的差異歸因于Kadcyla中存在高DAR物種。盡管Kadcyla包含類似的美登新有效載荷，但它是一種異質ADC，并且使用不同位點與賴氨酸偶聯的不同接頭化學制備，這些特性可能導致觀察到的ADC活性差異。

為了簡化整體醛標記方法，在過表達FGE的細胞中進行抗體表達。半胱氨酸到甲酰甘氨酸轉化的效率范圍為86%至98%，具體取決于偶聯位點。標記抗體和肼有效載荷之間的偶聯效率通常為75%或更高，盡管需要8-10當量有效載荷才能獲得含有兩種藥物/抗體的ADC。此外，在最終純化步驟中，需要制備型疏水作用層析（HIC）來去除未偶聯的抗體，這引發了有關將工藝擴展到臨床開發所需水平的問題。

分選酶A

其他酶介導的方法已被用于生成均相ADC。例如，Beerli及其同事設計了一個抗體重鏈和/或輕鏈C末端的轉肽酶（分選酶A）的識別序列。分選酶A催化聚甘氨酸底物轉移到五肽序列基序LPXTG的C端，從而與抗體形成穩定的酰胺鍵（方案4C）。通過將包含LPETG識別基序的工程曲妥珠單抗和cAC10變體與含有五甘氨酸接頭的MMAE或DM1有效載荷偶聯來構建ADC。與傳統的Kadcyla和Adcetris對照相比，所得ADC的均一性更高，經親和層析純化后，每抗體含有約1.8種藥物。值得注意的是，盡管DAR較低，但均一曲妥珠單抗ADC在表達Her2的異種移植腫瘤中顯示出與Kadcyla相當的療效。對含有auristatin有效載荷的ADC的其他研究正在進行中，以證明與替代有效載荷一起使用的方法的多功能性。

糖基轉移酶

已經報道了其他酶介導的位點特異性偶聯方法，這些方法不需要重組工程。例如，周及其同事使用糖基trasferases將末端唾液酸部分摻入與曲妥珠單抗和其他兩種抗體中的天然Asn297糖基化位點相連的聚糖中。工程唾液酸基團與高碘酸鈉的溫和氧化產生兩個醛基，用于與適當修飾的有效載荷進行位點特異性結合。糖工程抗體與含有氨基-氧接頭的auristatin有效載荷（MMAE和MMAD）偶聯，導致與抗體形成穩定的肟鍵（方案4D）。與目前討論的其他方法不同，該方法不需要重組抗體工程，但需要相對大量的接頭有效載荷（24當量）來生產含有1或2種藥物/抗體的ADC。未報道ADC的體內穩定性和藥代動力學特性，但它們在異種移植腫瘤模型中表現出與常規對照相當的活性。

內切糖苷酶

vanGeel及其同事最近報道了另一種涉及Asn297聚糖重塑的位點特異性偶聯的非重組方法。多階段過程從用內切糖苷酶處理抗體開始，以去除核心GlcNAc部分。這使得使用糖基轉移酶實現疊氮化物修飾的GalNAc類似物的位點特異性連接。然后，通過無銅點擊化學（方案4E），將所得疊氮化物標記的抗體與帶有雙環壬炔（BCN）接頭的有效載荷偶聯。使用五種不同的有效載荷結合可切割或不可切割的連接器合成了各種不同的連接器-有效載荷結構。偶聯效率通常為>95%，并且在療效研究中，ADC（曲妥珠單抗-BCN-PEG-DM1）優于Kadcyla。

基于鏈接器的方法

用于位點特異性偶聯的工程化氨基酸和酶介導的方法已成功生產具有更高均一性的ADC，并導致其他ADC特性（如穩定性、效力和安全性）的顯著改善。此外，與傳統的異質性基準相比，迄今為止討論的大多數方法都產生了具有相當或更好的治療窗口的ADC。然而，同質性對ADC活性的相對影響仍然不確定，因為同質ADC通常包含與基準ADC中使用的不同的有效載荷和偶聯位點。利用與傳統ADC相同的偶聯位點的偶聯方法應該能夠更可靠地確定均一性對ADC活性的影響，因為可以消除其他變量。大多數基于接頭的構建均相ADC的工藝利用鏈間半年胱氨酸進行偶聯，以提供具有4種或8種藥物/抗體的均相ADC。這些過程是化學驅動的，與之前討論的工藝不同，因為它們專注于接頭修飾。因此，它們可以應用于現有的“現成”抗體，并且不需要重組抗體再造或非常規表達系統。

親水接頭

如前所述，通過鏈間半胱氨酸偶聯的具有8個有效載荷/抗體的ADC被證明具有次優的藥理學特性，部分歸因于用于制備其的常規有效載荷的疏水性。考慮到這一點，Seattle Genetics的研究人員假設親水接頭和有效載荷將能夠構建滿載的ADC（DAR=8種藥物/抗體），而不會影響其他所需的特性。Doronina等人的早期研究表明，二肽接頭可用于通過其C端偶聯auristatins，以產生異質ADC，其效力優于傳統的auristatin ADC。

Lyon及其同事通過用親水性更強的氨基酸蘇氨酸取代auristatinF中的C端苯丙氨酸，合成了類似的疏水性降低的auristatin衍生物。然后將所得衍生物（auristatinT）通過C端連接到親水性二肽馬來酰亞胺接頭（方案5A）。然后將親水性有效載荷與抗CD70抗體（h1F6）偶聯，得到含有8種藥物/抗體的均相ADC。將滿載ADC與包含傳統接頭（MC或MC-VC-PAB）和有效載荷（MMAF）的ADC進行了比較，結果表明，與傳統ADC相比，清除速度更慢，功效更高。

方案5.基于連接器的同構ADC綜合方法

方案a（A）水系接頭;減少鏈間半年胱氨酸，然后與含有水系接頭的有效載荷偶聯，產生具有8種藥物/抗體的ADC。（B）鏈間二硫鍵還原，然后與雙砜接頭偶聯形成三原子二硫鍵，并產生具有4種藥物/抗體的ADC。（C）NGM（下一代馬來酰亞胺）。鏈間二硫鍵還原，然后添加含有炔烴基團的二硫噻苯馬來酰亞胺接頭，使其能夠與含有疊氮化物基團的有效載荷偶聯。偶聯反應與抗體形成三唑鍵，并為ADC提供4種藥物/抗體。（D）二溴吡嗪二酮與鏈間半胱氨酸反應，得到具有4個接頭/抗體的ADC。每個接頭包含兩個不同的疊氮化物基團，以實現兩種不同有效載荷的偶聯。

結果使作者得出結論，“降低均相ADC的疏水性可以提高藥代動力學和治療指數”，正如文章標題所反映的那樣。然而，ADC親水性與藥理學特性的改善相關，然而，與研究中比較的ADC相關，它們都包含不同的有效載荷，以不同的方向（N或C末端）連接到不同的接頭。由于這些因素也會對ADC的整體特性產生重大影響，因此無法確定降低的疏水性對改善治療指數的相對貢獻。

雙烷基化接頭

大多數基于接頭合成均相ADC的方法利用雙功能接頭，旨在交聯抗體鏈間半胱氨酸，并提供包含四種藥物/抗體的均相ADC。Badescu及其同事報告了這種方法的一個例子，他們合成了雙砜接頭，旨在交聯兩個半胱氨酸并形成3碳橋（方案5B）。雙砜交聯基團通過可切割的PEG墊片連接到MMAE上，并與曲妥珠單抗偶聯，得到DAR4為78%的ADC。所得ADC在各種條件下比傳統的馬來酰亞胺ADC更穩定，并且在體外對Her2陽性細胞具有中等效力。進行了療效研究，雙烷基化ADC顯示出優于非偶聯曲妥珠單抗的效力，盡管腫瘤生長抑制需要多次高劑量（>10mg/kg）。

在一項后續研究中，Godwin及其同事使用類似的有效載荷，通過改變偶聯反應的化學計量來構建每個抗體主要包含1、2、3或4種藥物的ADC。通過制備型疏水相互作用色譜（HIC）純化ADC以去除不需要的DAR組分，并在BT474異種移植腫瘤模型中進行測試。ADC療效與DAR增加相關，同樣，腫瘤生長抑制需要多次高劑量（>10mg/kg）。在JIMT-1異種移植物中進行了第二項研究，與T-DM1相比，雙烷基化ADC顯示出更高的效力。由于這些研究既未包括未結合的曲妥珠單抗，也未包括類似的異質性ADC對照，因此無法確定雙烷基化接頭對ADC總體治療指數的相對影響。

下一代馬利酰亞胺（NGM）

替代試劑已用于交聯鏈間半胱氨酸，與前面討論的雙砜接頭相比，效率更高。UCL（倫敦大學學院）的研究人員發表了一系列論文，其中取代的馬來酰亞胺被證明是高效的半胱氨酸交聯劑。取代馬來酰亞胺的早期應用包括二硫鍵保護、蛋白質聚乙二醇化和熒光標記。Moody及其同事后來報告說，溴馬來酰亞胺連接的生物偶聯物在哺乳動物細胞中是可切割的，最近報道了許多基于抗體的取代馬來酰亞胺的應用。

例如，倫敦大學學院（UCL）的Caddick及其同事報告了使用三步工藝合成均相曲妥珠單抗ADC。用TCEP還原鏈間二硫鍵，然后添加N-炔丙基-3,4-二硫代苯基馬來酰亞胺接頭，以與抗體形成二硫代馬來酰亞胺鍵。添加疊氮基-多柔比星衍生物導致與有效載荷形成三唑鍵（方案5C）。該過程應用于曲妥珠單抗，并提供具有四種藥物/抗體的均相ADC。與母體抗體相比，ADC表現出相當的抗原結合親和力，但未報道體內藥理學特性。與傳統的半胱氨酸偶聯方法不同，抗體H鏈和L鏈之間的共價鍵得以保持，這有望提高交聯ADC的穩定性。

二溴吡噠嗪二酮類

Maruaini及其同事后來發表了一種類似的交聯方法，該方法使用包含雙正交炔烴官能團的二溴吡咪嗪二酮接頭。該接頭旨在通過點擊化學與兩種不同的疊氮化物衍生物進行化學選擇性偶聯（方案5D）。多柔比星和熒光團均經過疊氮化物基團修飾，依次與赫賽汀偶聯，得到具有四個有效載荷和四個熒光團的ADC。雙標記ADC在血漿中穩定，并在μM濃度下選擇性殺死Her2陽性BT474細胞。雖然沒有報道ADC在體內的藥理學特性，但結果表明，類似的策略可用于將兩種不同的有效載荷與具有單個接頭的抗體偶聯。

二溴馬來酰亞胺

為了確定鏈間半胱氨酸交聯對ADC體內特性的影響，Behrens及其同事合成了一種單甲基auristatinF的衍生物，該衍生物含有二溴馬來酰亞胺（DBM）接頭，而不是傳統的馬來酰亞胺。DBM-MMAF有效載荷旨在交聯鏈間半年胱氨酸，以與抗體形成二硫代馬來酰亞胺鍵（方案6）。DBM-MMAF有效載荷與曲妥珠單抗和一種新型抗CD98抗體偶聯，以獲得具有四種藥物/抗體的均相ADC。ADC在體外選擇性地與表達抗原的細胞結合，具有與母體抗體相當的親和力，并在亞納摩爾濃度下抑制生長。將交聯ADC在體內的藥理學特性與使用常規馬來酰亞胺（MC）接頭合成的類似異質ADC進行了比較。結果表明，DBM接頭直接從各種不同的抗體中產生均相ADC，無需重組工程。重要的是，DBM交聯ADC比類似的常規異質ADC表現出更好的藥代動力學、安全性和有效性。

方案6.（a）通過半胱氨酸交聯合成同相ADC（B）比較DBM交聯ADC（藍色）與類似常規ADC（紅色）的疏水作用色譜（HIC）分析

方案A鏈間二硫鍵用TCEP還原，然后與含有二溴馬來酰亞胺DBM接頭的有效載荷偶聯，以獲得具有4種藥物/抗體的均相ADC。

與之前討論的大多數方法相比，DBM偶聯方案需要的步驟更少，并且始終提供具有>90%DAR4的ADC。還原和偶聯過程可以在室溫下在一個罐中依次進行，不到3小時。與生成均相ADC的其他方法不同，無需使用過量試劑，并且該過程很容易擴展到克級。粗偶聯混合物的緩沖液置換或膜過濾可提供高純度的ADC。DBM交聯方法是第一項將同質ADC與包含相同接頭和與相同位點偶聯的有效載荷的類似異質ADC直接進行比較的研究。由于從研究中有效地去除了其他已知影響ADC特性的變量，因此可以準確確定同質性和鏈間半胱氨酸交聯的相對貢獻。結果表明，相對于傳統方法，使用DBM的鏈間交聯不會對體內的ADC活性產生不利影響。此外，結果提供了令人信服的證據，證明同質ADC優于異質ADC，并驗證了之前構建具有確定DAR的同質ADC的努力。

本文回顧的所有工藝都已成功用于構建比使用傳統方法合成的ADC具有更好的均勻性。大多數方法利用重組抗體工程技術為位點特異性偶聯引入獨特的官能團。獨特的官能團作為半胱氨酸和非天然氨基酸的點突變或作為酶識別標簽引入。與非重組方法相比，這些重組工程方法具有多種潛在優勢。例如，工程半胱氨酸可以摻入數十個不同的位點，對抗體的功能特性影響最小。這使得ADC能夠針對偶聯效率、接頭穩定性和效力進行優化。工程非天然氨基酸由于可以引入多種不同的官能團而具有額外的優勢。此外，非天然氨基酸能夠研究各種新的接頭化學成分，這是傳統偶聯工藝無法實現的。

重組工藝提供的靈活性也可能是他們面臨的最大挑戰。偶聯位點對ADC活性的重要性已得到充分證實，但在選擇開發候選基因之前應考慮其他因素。在選擇特定的偶聯位點之前，需要考慮對抗體表達、偶聯效率、接頭穩定性、聚集和其他因素的潛在影響。這些因素最終可以決定ADC開發項目的成敗。由于抗體具有許多相同的特性，因此似乎很可能會確定最佳偶聯位點，這些位點在與不同的抗體一起使用時廣泛有效。涉及抗體工程的工藝面臨的其他潛在挑戰包括開發時間和成本增加、工程序列標簽的免疫原性、可擴展性以及使用尚未臨床驗證的新型接頭和有效載荷。

除了均勻性外，還觀察到其他ADC特性（如效力、穩定性和半衰期）的改善。事實上，從這些過程中衍生的許多同質ADC在療效和安全性研究中的性能優于傳統的異質ADC。他們的成功在很大程度上歸功于消除了傳統ADC中存在的高DAR物質。總的來說，實驗結果與這一結論一致，許多人會同意這些提高ADC同質性的努力已經取得了實質性進展。具有諷刺意味的是，大多數研究無法確定同質性對工程ADC性能改善的相對貢獻，因為不能排除其他已知影響ADC活性的因素。

例如，制備均相ADC的重組方法被設計為在與傳統方法中使用的不同位置引入偶聯位點。由于現在已經確定“位置很重要”，因此觀察到的TDC（或NDC）和常規ADC對照之間的活性差異可能是由于不同的偶聯位點造成的，而不是由于消除了高DAR物質。在比較均相和異質ADC時，酶介導的方法面臨著類似的挑戰，因為偶聯位點不同。在得出有關均一性益處的結論之前，需要仔細控制其他變量，例如接頭類型（可切割或不可切割）和有效載荷（美登新或PBD）。

基于Linker的工藝更適合比較同質ADC和傳統的異質ADC，因為它們使用相同的偶聯位點。一旦仔細控制了可能影響ADC活性的其他變量，同質性的相對優勢就首次顯現出來，結果證實了提高ADC同質性的努力是一項值得的努力。

這里回顧的大多數過程仍處于臨床開發的早期階段。所有方法都有優點和局限性，最終將決定哪種方法將成為制造同質ADC的首選工藝。目前尚不清楚哪種工藝會成為首選方法，但所有這些方法都為我們的知識庫提供了有價值的信息，并導致ADC的藥理學特性優于傳統的異質ADC。我們未來的挑戰將是應用這些知識來開發作為治療劑更有效的ADC。我們合成同構ADC的能力為我們對ADC的未來持樂觀態度提供了另一個理由。

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